天然药物化学成分的提取分离和鉴定方法

1、Natural Products Chemistry 天然药物化学成分的天然药物化学成分的提取、分离和鉴定提取、分离和鉴定基本内容基本内容v中药有效成分的提取分离方法中药有效成分的提取分离方法v 1H-NMR、 13C-NMR在结构研究中的的作用及解析方法在结构研究中的的作用及解析方法;质谱的类型及其应用质谱的类型及其应用 1.1.溶剂提取法溶剂提取法2.2.水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法3.3.升华法升华法4.4.超临界流体萃取法超临界流体萃取法5.5.超声波提取法超声波提取法6. 6. 微波提取法微波提取法 1.溶剂提取法（溶剂提取法（extraction with solvent） 原理：相似

2、相溶原理：相似相溶 理想溶剂理想溶剂（ideal solvents ）有如下特点有如下特点 （1 1）对有效成分溶解度大；）对有效成分溶解度大； （2 2）对无效成分溶解度小；）对无效成分溶解度小； （3 3）与有效成分不起化学反应；）与有效成分不起化学反应； （4 4）安全，成本低，易得。）安全，成本低，易得。溶剂的极性由弱至强的顺序：石油醚溶剂的极性由弱至强的顺序：石油醚氯仿氯仿乙酸乙酸乙酯乙酯正丁醇正丁醇丙酮丙酮甲醇甲醇水水 一、提取法：一、提取法：1.溶剂提取法（溶剂提取法（extraction with solvent）影响提取的因素：影响提取的因素：药材的粉碎度药材的粉碎度：一般以

3、：一般以20-6020-60目为度。目为度。温度：温度：对热不稳定的温度不宜过高。对热不稳定的温度不宜过高。浓度差：浓度差：搅拌、换溶剂、渗漉。搅拌、换溶剂、渗漉。提取时间：提取时间：水加热提取水加热提取1-21-2小时，乙醇加热小时，乙醇加热1 1小时为宜。小时为宜。Simple percolate assembly 1)冷提取法：冷提取法：适用于受热不稳定的成分。适用于受热不稳定的成分。 浸渍浸渍 (Maceration) 渗漉（渗漉（Percolation）工业生产用的渗漉装置工业生产用的渗漉装置2)热提取法：煎煮法（热提取法：煎煮法（Decoction） 回流（回流（Refluxing

4、） 连续回流（连续回流（Continuous Refluxing）Simple refluxing assembly Assembly of Soxhlet extractor 2.水蒸气蒸馏法（水蒸气蒸馏法（water-steam distillation ） 提取具有挥发性，能随水蒸气提取具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的成分，如挥发油。蒸馏而不被破坏的成分，如挥发油。 Simple water-steam distillation refluxing assembly3.升华法（升华法（ sublimation ） 用于具有升华性的成分提取，如香豆素，蒽醌，用于具有升华性的成分提取，

5、如香豆素，蒽醌，樟脑等。樟脑等。l 超临界流体的密度与液体很接近超临界流体的密度与液体很接近，而它又具有气体而它又具有气体扩散性能扩散性能l常用的临界流体有常用的临界流体有CO2、N2O、 乙烷、丙烷乙烷、丙烷等。等。4.超临界流体提取法（超临界流体提取法（supercritical fluid extraction SFE) 利用溶剂在超临界条件下特殊的流体性能对样品进利用溶剂在超临界条件下特殊的流体性能对样品进行提取，为行提取，为20世纪世纪80年代迅速发展起来的一种提取方年代迅速发展起来的一种提取方法法。超临界萃取实验装置与实验方法超临界萃取实验装置与实验方法CO2钢瓶冷温槽流量计小试实

6、验装置图实验装置小型实验装置中小型 为物理过程，无化为物理过程，无化学反应，生物活性不学反应，生物活性不减。大能量的超声波减。大能量的超声波产生的极大压力造成产生的极大压力造成植物细胞壁及整个生植物细胞壁及整个生物体破裂，胞内物质物体破裂，胞内物质的释放、扩散及溶解。的释放、扩散及溶解。5.超声提取法（超声提取法（ultrasonic extraction)实验室用小型超声仪实验室用小型超声仪工工业业生生产产用用超超声声仪仪6.微波提取法（微波提取法（microwave extraction） 具有穿透力强、选择性高、具有穿透力强、选择性高、加热效率高等显著特点，而加热效率高等显著特点，而且其

7、操作简便、快速、节能、且其操作简便、快速、节能、高效。高效。缺点缺点：工业化设备少、成分：工业化设备少、成分变化、生物活性变化。变化、生物活性变化。工业生产用微波提取罐工业生产用微波提取罐1.1. 根据根据溶解度溶解度差别进行分离差别进行分离2.2. 根据物质在两相溶剂中的根据物质在两相溶剂中的分配比分配比不同进行分离不同进行分离3.3. 根据物质的根据物质的吸附性吸附性差别进行分离差别进行分离吸附色谱法吸附色谱法4. 根据物质根据物质离解程度不同离解程度不同进行分离进行分离离子交换法离子交换法5. 5. 根据物质根据物质分子大小差别分子大小差别进行分离进行分离凝胶滤过法凝胶滤过法1. 1.

8、根据根据溶解度溶解度差别进行分离差别进行分离 1.1 1.1 结晶法结晶法（纯化时常用）（纯化时常用）条件：浓度；合适的溶剂；温度条件：浓度；合适的溶剂；温度1.2 1.2 沉淀法沉淀法a a 分级沉淀法：改变极性，如水提醇沉法分级沉淀法：改变极性，如水提醇沉法b b 酸碱沉淀法：改变酸碱沉淀法：改变pHpH，处理酸、碱、两性成分；处理酸、碱、两性成分；c c 专属试剂沉淀法：如铅盐沉淀法，酸性、酚性成专属试剂沉淀法：如铅盐沉淀法，酸性、酚性成分加中性分加中性PbAcPbAc2 2，形成沉淀。形成沉淀。d d 盐析法：水溶液中加入无机盐盐析法：水溶液中加入无机盐1.1 1.1 结晶法结晶法关键

9、：关键：选择合适的溶剂选择合适的溶剂 对被溶解成分的溶解度随温度不同应有显著差别对被溶解成分的溶解度随温度不同应有显著差别与被结晶成分不应产生化学反应与被结晶成分不应产生化学反应 沸点适中沸点适中a a 分级沉淀法：分级沉淀法：改变极性改变极性水提醇沉法：含有糖类或蛋白质的水溶液中，分次加水提醇沉法：含有糖类或蛋白质的水溶液中，分次加入乙醇，使含醇量逐步增高，逐级沉淀出分子量段入乙醇，使含醇量逐步增高，逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽等。由大到小的蛋白质、多糖、多肽等。在含皂苷的乙醇溶液中分次加入乙醚或乙醚在含皂苷的乙醇溶液中分次加入乙醚或乙醚- -丙酮混丙酮混合液可使极性有差异

10、的皂苷逐段沉淀出来。合液可使极性有差异的皂苷逐段沉淀出来。b b 酸碱沉淀法：改变酸碱沉淀法：改变pHpH，处理酸、碱、两性成分；处理酸、碱、两性成分； 碱性成分：碱性成分：生物碱类与无机酸成盐溶于水，调节生物碱类与无机酸成盐溶于水，调节pHpH碱化后生物碱游离出来，在水溶液中沉淀析出。碱化后生物碱游离出来，在水溶液中沉淀析出。 酸性成分：酸性成分：对于具有羧基或酚羟基的酸性成分，与对于具有羧基或酚羟基的酸性成分，与碱成盐而溶于水，酸化后游离出来，在水溶液中沉碱成盐而溶于水，酸化后游离出来，在水溶液中沉淀析出。淀析出。注意：酸碱处理结构的变化。注意：酸碱处理结构的变化。c c 专属试剂沉淀法：

11、专属试剂沉淀法：雷氏铵盐雷氏铵盐用于分离生物碱与非生物碱类成分，以及用于分离生物碱与非生物碱类成分，以及水溶性生物碱与其他生物碱的分离；水溶性生物碱与其他生物碱的分离；胆甾醇能和甾体皂苷沉淀，可使其与三萜皂苷分离。胆甾醇能和甾体皂苷沉淀，可使其与三萜皂苷分离。明胶能沉淀鞣质，可用于分离或除去鞣质。明胶能沉淀鞣质，可用于分离或除去鞣质。d d 盐析法：水溶液中加入无机盐盐析法：水溶液中加入无机盐2.1 影响分离的因素影响分离的因素分离因子分离因子，分配系数分配系数K= kA/ kB kAkB, k=CU/CL （CU, CL被分离物质在上相和下相中浓度）被分离物质在上相和下相中浓度） 根据根据值

12、的大小可决定分离采用的方法值的大小可决定分离采用的方法:100，简单的一次萃取，可基本分离简单的一次萃取，可基本分离.10010，10-12次萃取，次萃取，CCD法。法。2，100次以上萃取，次以上萃取，DCCC法，法，HSCCC法。法。=1，不能分离。不能分离。2.2. 根据物质在两相溶剂中的根据物质在两相溶剂中的分配比分配比不同进行分离不同进行分离或用或用PC法求法求值，选择理想分离条件。值，选择理想分离条件。 纸色谱（纸色谱（PC）也叫纸分配色谱（也叫纸分配色谱（PPC， Paper Partition Chromatography）。）。KAKB=1rRfa1-Rfa1rRfb1-Rf

13、b=Rfa (1-Rfb)Rfb (1-Rfa)（ 纸色谱定数）纸色谱定数）Rfa，Rfb为为A，B两物质在两物质在PC上上Rf值值= 2.1 影响分离的因素影响分离的因素 pH值值 对于酸性、碱性、两性化合物，对于酸性、碱性、两性化合物，pH值可改变值可改变它们的存在状态（游离型和解离型）它们的存在状态（游离型和解离型），分配比分配比受受pH值的影响，因为值的影响，因为HA + H2OA- + H3+OKa =A- H3+OHApka = pH- log A- / HApH= pKa + log A- / HAHA达到达到99%解离时，解离时，pH= pKa + 2HA达到达到99%游离时，

14、游离时，pH= pKa - 22.2 酸碱性成分的分离酸碱性成分的分离pH-梯度萃取法梯度萃取法、酸碱溶酸碱溶剂法剂法 按酸碱性强弱不同分离酸性、碱性、中性物质，按酸碱性强弱不同分离酸性、碱性、中性物质，改变改变pH值值使酸碱成分呈不同状态。使酸碱成分呈不同状态。 pH-梯度萃取法梯度萃取法 酸碱溶剂法酸碱溶剂法 洋金花粗粉30g(揉碎)0.5%HCl(V/V,自配) 300ml冷浸30分钟 棉花过滤，滤液再用滤纸加硅藻土抽滤一次 酸水液取60ml酸水液加浓氨水调PH值至11，加氯仿萃取3次，每次20ml氯仿层（总碱的氯仿液） 简单萃取简单萃取分离分离极性较大极性较大的成的成分：分：正丁醇正丁

15、醇- -水水分离分离极性中等极性中等成分：成分：乙酸乙酯乙酸乙酯- -水水分离分离极性小极性小的成分：的成分：氯仿氯仿( (或乙醚或乙醚)-)-水水石油醚石油醚脱脂脱脂2.3 溶剂分配法溶剂分配法2.3 溶剂分配法溶剂分配法Sinoodophyllum emodi (Wall.)Ying(18.8Kg)extracted with 95% EtOHEtOH extractsuspended in waterpartitioned with petroleum, CHCl3,ethyl acetate, n-butanol successivelypetroleum(93g) CHCl3(160

16、0g) ethyl acetate(157g) n-butanol(480g) water layer系统溶剂萃取法系统溶剂萃取法2.2 酸碱性成分的分离酸碱性成分的分离pH-梯度萃取法梯度萃取法、酸碱溶酸碱溶剂法剂法 按酸碱性强弱不同分离酸性、碱性、中性物质，按酸碱性强弱不同分离酸性、碱性、中性物质，改变改变pH值值使酸碱成分呈不同状态。使酸碱成分呈不同状态。 2.3 逆流分溶法、液滴逆流色谱、高速逆流色谱逆流分溶法、液滴逆流色谱、高速逆流色谱 逆流分溶法逆流分溶法(CCD)： 多次连续液多次连续液-液萃取分离过程。液萃取分离过程。 特点特点：条件温和，样品易回收，适用于中等极性、：条件温和

17、，样品易回收，适用于中等极性、不稳定物质的分离。不稳定物质的分离。 液滴逆流色谱液滴逆流色谱(DCCC): 一种液一种液- -液分配色谱，流动相呈液滴形式垂直液分配色谱，流动相呈液滴形式垂直上升或下降，通过固定相的液柱，实现物质的上升或下降，通过固定相的液柱，实现物质的逆流色谱分离。逆流色谱分离。 特点：特点：不易乳化，样品可定量回收，分离效不易乳化，样品可定量回收，分离效果好，特别适合于分离皂苷等水溶性成分。果好，特别适合于分离皂苷等水溶性成分。 缺点缺点：样品处理量小。：样品处理量小。高速逆流色谱高速逆流色谱（HSCCC） 通过特定的高速行星式旋转所产生的离心通过特定的高速行星式旋转所产生

18、的离心力场力场作用，使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形作用，使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管管内，并使流动相单向、低速通过固定相，实现连内，并使流动相单向、低速通过固定相，实现连续续逆流萃取分离物质的目的。逆流萃取分离物质的目的。 用于各种物质的分离，包括蛋白、酶、三萜、用于各种物质的分离，包括蛋白、酶、三萜、生生物碱、皂苷等。物碱、皂苷等。2.4 液液-液分配柱色谱液分配柱色谱 正相色谱：正相色谱： 固定相固定相极性大极性大，如氰基与氨基键和相、水、缓冲液，如氰基与氨基键和相、水、缓冲液等；等； 流动相流动相极性小极性小，如氯仿、乙酸乙酯等。，如氯仿、乙酸乙酯等。载体：硅胶（含水可达

19、载体：硅胶（含水可达17%），硅藻土，纤维素等。），硅藻土，纤维素等。分离极性大或中等极性的成分。分离极性大或中等极性的成分。 洗脱顺序：极性小的物质先被洗脱出来。洗脱顺序：极性小的物质先被洗脱出来。2.4 液液-液分配柱色谱液分配柱色谱 反相色谱：反相色谱：固定相极性小于流动相固定相极性小于流动相。如。如HPLC反反相柱，反相板。相柱，反相板。 固定相固定相：硅胶硅醇基结合烷基，如：硅胶硅醇基结合烷基，如RP-2，RP-8，RP-18。亲脂性：亲脂性：RP-18 RP-8 RP-2。 流动相流动相(洗脱剂洗脱剂)：MeOH-H2O，CH3CN-H2O 洗脱顺序：洗脱顺序：分离非极性及中等极性

20、的成分分离非极性及中等极性的成分，极性，极性大者先洗脱下来。大者先洗脱下来。 3.1 吸附分类：吸附分类： 物理吸附物理吸附：无选择性的吸附，吸附解析发生迅：无选择性的吸附，吸附解析发生迅速。吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭等；速。吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭等； 化学吸附化学吸附：不可逆性。如碱性氧化铝对酚酸性成：不可逆性。如碱性氧化铝对酚酸性成分的吸附，硅胶对生物碱的吸附等。分的吸附，硅胶对生物碱的吸附等。 半化学吸附半化学吸附：聚酰胺对酚酸类、醌类的氢键吸附。：聚酰胺对酚酸类、醌类的氢键吸附。3.3. 根据物质的根据物质的吸附性吸附性差别进行分离差别进行分离吸附色谱法吸附色谱法吸附原理：相似

21、相吸吸附原理：相似相吸影响吸附过程的三要素：影响吸附过程的三要素： 吸附剂（固定相），吸附剂（固定相）， 溶质（被分离物质），溶质（被分离物质）， 溶剂（洗脱剂，展开剂，流动相）溶剂（洗脱剂，展开剂，流动相）3.2 硅胶、氧化铝：硅胶、氧化铝： 极性吸附剂极性吸附剂：载样量大，：载样量大，吸吸附力强附力强 硅胶硅胶：应用最广，：应用最广，适用于适用于各各类成分分离类成分分离 氧化铝氧化铝：有中性、酸性、：有中性、酸性、碱碱性氧化铝。性氧化铝。碱性氧化铝不适碱性氧化铝不适合合于分离酸性成分，多用于分于分离酸性成分，多用于分离离生物碱生物碱。3.2 硅胶、氧化铝：硅胶、氧化铝： 被分离物质吸附力与

22、结构的关系被分离物质吸附力与结构的关系 被分离物质极性大，吸附力强，被分离物质极性大，吸附力强，Rf值小，洗脱值小，洗脱难，难，后被洗脱下来。后被洗脱下来。 官能团极性大小排列顺序：官能团极性大小排列顺序： -COOH Ar-OH R-OH R-NH2, RNHR , RNR R R-CO-NRR RCHO RCOR RCOOR ROR RH3.2 硅胶、氧化铝：硅胶、氧化铝：溶剂溶剂( (洗脱剂洗脱剂) )的极性与洗脱力的关系的极性与洗脱力的关系洗脱剂极性越大洗脱剂极性越大, , 洗脱力越强洗脱力越强. .石油醚石油醚- -丙酮丙酮石油醚石油醚- -乙酸乙酯乙酸乙酯氯仿氯仿- -甲醇甲醇 练

23、习练习: : 从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷成从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷成分分, , 比较极性大小和硅胶柱上洗脱顺序比较极性大小和硅胶柱上洗脱顺序. .名称名称RR黄夹苷黄夹苷ACHO(D-Glc)2黄夹苷黄夹苷BCH3(D-Glc)2黄夹次苷黄夹次苷ACHOH黄夹次苷黄夹次苷BCH3H黄夹次苷黄夹次苷CCH2OHH黄夹次苷黄夹次苷DCOOHH单乙酰黄夹单乙酰黄夹次苷次苷BCH3H单乙酰黄夹次苷单乙酰黄夹次苷B R”=COCH3, 其它其它R”=HOROHOCH3OROCH3OROO答案：答案：1. 1. 极性大极性大 小：黄夹苷小：黄夹苷A A黄夹苷黄夹苷B B 次次苷苷D D次

24、苷次苷C C次苷次苷A A次苷次苷B B 单乙酰黄夹单乙酰黄夹次苷次苷B2. 2. 硅胶柱上的出柱顺序：后硅胶柱上的出柱顺序：后 先先 3.2 活性炭活性炭非极性吸附剂非极性吸附剂 吸附力与结构的关系吸附力与结构的关系 分子量大者分子量大者 分子量小者分子量小者 芳香族芳香族 脂肪族脂肪族 含含OH, COOH, NH2多者多者 少者少者 洗脱力与溶剂的关系洗脱力与溶剂的关系 吡啶吡啶 15%酚酚/醇醇 7%酚酚/H2O 醇醇 含水含水醇醇H2O 应用应用: 黄酮、生物碱的富集，糖的分离、脱色等。黄酮、生物碱的富集，糖的分离、脱色等。CH2COHOCH2NCH2CCH2H2CCH2H2CNHH

25、OOOHHOOH2CCNCH2H2CCH2H2CCH2CNH2C固 定 相 移动相3.4 聚酰胺聚酰胺(Polyamide) 是由己酰胺聚合成的一是由己酰胺聚合成的一类高分子化合物。类高分子化合物。分离原理分离原理：主要通过：主要通过酰胺键与酚羟基、酸、醌等形成酰胺键与酚羟基、酸、醌等形成氢键氢键，产生，产生吸附吸附作用。吸附力取决于作用。吸附力取决于形成氢键缔合的形成氢键缔合的能力能力。 3.4 聚酰胺聚酰胺 吸附力与结构的关系吸附力与结构的关系 a.a.形成氢键的基团数目越多形成氢键的基团数目越多, , 吸附力越强吸附力越强; ; b.b.形成分子内氢键者形成分子内氢键者, , 吸附力减少

26、吸附力减少; ; OHOHHOOHOHOHOHOHOHOHOHCOOHOHOHCOOHd.d.芳香苷苷元芳香苷苷元 苷苷, , 单糖苷单糖苷 双糖苷双糖苷 叁糖苷叁糖苷 c.c.芳香化程度越高或共轭键越多芳香化程度越高或共轭键越多, ,吸附力越强吸附力越强; ;OHOH3.4 聚酰胺聚酰胺 吸附力与结构的关系吸附力与结构的关系溶剂的洗脱能力溶剂的洗脱能力 水水 含水醇含水醇醇醇 丙酮丙酮NaOH/H2O甲酰胺甲酰胺二二甲基甲酰胺甲基甲酰胺 B ASiO2-TLC Rf: A B CPolyamide TLC, Rf: C B A答案：答案：3.5 大孔吸附树脂大孔吸附树脂(macro-reti

27、cular resin)组成组成: 苯乙烯，二乙烯苯和致孔剂苯乙烯，二乙烯苯和致孔剂分离原理分离原理:吸附吸附(范德华力和氢键范德华力和氢键)和和分子筛分子筛作用作用(多孔性结构多孔性结构)树脂类型树脂类型:非极性、中极性和极性三种。非极性、中极性和极性三种。 非极性非极性：由苯乙烯和二乙烯苯缩合而成，故又由苯乙烯和二乙烯苯缩合而成，故又称称 芳香吸附树脂。芳香吸附树脂。 中极性中极性：含脂基的吸附树脂：含脂基的吸附树脂。 极极 性性：含酰氨基、氰基、酚羟基等含氮、氧、：含酰氨基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫不同极性功能的吸附树脂。硫不同极性功能的吸附树脂。3.5 大孔吸附树脂大孔吸附树脂 洗脱

28、剂洗脱剂: H2O 及不同比例的含水醇。及不同比例的含水醇。 洗脱分离洗脱分离: H2O 洗洗: 糖糖,水溶性色素水溶性色素 30% EtOH/ H2O: 极性大的成分极性大的成分 50-75% EtOH: 皂苷类皂苷类 95% EtOH: 极性小成分极性小成分 应用应用: 除多糖除多糖, 水溶性色素水溶性色素, 富集苷类成分富集苷类成分4.根据物质根据物质离解程度不同离解程度不同进行分离进行分离离子交换法离子交换法 固定相固定相：离子交换树脂（聚苯乙烯高分子化合物，：离子交换树脂（聚苯乙烯高分子化合物，引引 入交换基团）入交换基团） 分类：分类： 阳离子交换树脂：强酸型阳离子交换树脂：强酸型

29、 RSO3-H+ 弱酸型弱酸型 RCOO-H+ 阴离子交换树脂：强碱型阴离子交换树脂：强碱型 RN+(CH3)3Cl- 弱碱型弱碱型 RNH2, RNHR, RNRR” 4.1交换原理交换原理: 阳离子交换树脂：阳离子交换树脂：R-N+(CH3)3Cl- + RCOO-R-N+(CH3)3 .RCOO-HClR-N+(CH3)3Cl- + RCOOHR-SO3-H+ + BH+R-SO3-BH+OH-R-SO3-H+ B 阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：4.2应用：应用：主要用于主要用于生物碱生物碱和和有机酸有机酸的分离。的分离。4.根据物质根据物质离解程度不同离解程度不同进行分离进行分离离子

30、交换法离子交换法 透析法透析法: : 半透膜半透膜, , 分子筛滤过作用分子筛滤过作用 超滤法超滤法: : 分子大小不同分子大小不同, , 扩散速度不同扩散速度不同 超速离心法超速离心法: : 溶质在超速离心作用下具有不同溶质在超速离心作用下具有不同的的 沉降性或浮游性沉降性或浮游性 凝胶滤过法凝胶滤过法: : 分子筛的作用分子筛的作用( (凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱, ,分分子子 筛滤过筛滤过, , 排阻色谱排阻色谱), ), 被分离物质按被分离物质按分子分子 由大到小的顺序流出色谱柱由大到小的顺序流出色谱柱. .5.5.根据物质根据物质分子大小差别分子大小差别进行分离进行分离凝胶滤过法凝胶滤

31、过法5.1 5.1 主要的几种方法主要的几种方法5.2凝胶种类凝胶种类:葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex G): 只适于在只适于在水水中应用中应用, 分离多糖分离多糖、 蛋白质等蛋白质等.羟丙基葡聚糖凝胶羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)： 适用于各类化合物的分离，除具有分子筛的特适用于各类化合物的分离，除具有分子筛的特性外，还起到反相分配色谱的效果。性外，还起到反相分配色谱的效果。 常用溶剂有常用溶剂有甲醇、氯仿甲醇、氯仿-甲醇甲醇等。等。5.5.根据物质根据物质分子大小差别分子大小差别进行分离进行分离凝胶滤过法凝胶滤过法 1. 测熔点测熔点: 看熔程看熔程 2. 外观结

32、晶色泽与形状外观结晶色泽与形状: 均一性均一性 3. 色谱法色谱法: TLC 三种组成不同的溶剂系统三种组成不同的溶剂系统, 单一单一斑点斑点; HPLC 单一峰单一峰 GC 单一峰单一峰 4. 核磁法核磁法：不主张。：不主张。？ 1. 有标准品有标准品(或对照品或对照品): Co-TLC (共薄层，三种系统共薄层，三种系统) 测混合熔点测混合熔点(相同溶剂结晶相同溶剂结晶); 测测IR (考察是否重叠）考察是否重叠） 2. 无标准品无标准品: 与文献值对照与文献值对照(相同的溶剂条件下：相同的溶剂条件下：m.p., IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR等等)。三、未知化合物三、未知

33、化合物 程序程序 1.结构类型的确定结构类型的确定 2. 分子式及不饱和度分子式及不饱和度 的确定的确定 3. 官能团和分子骨架的确定官能团和分子骨架的确定 4. 平面结构的确定平面结构的确定 5. 立体结构的确定立体结构的确定三、未知化合物三、未知化合物 多种谱学结合的结构解析多种谱学结合的结构解析 1.紫外光谱紫外光谱(Ultraviolet spectra UV) 为结构解析提供的信息为结构解析提供的信息 用于判断结构中的共轭系统、结构骨架（如用于判断结构中的共轭系统、结构骨架（如香香豆素、黄酮）豆素、黄酮） UV谱一致，不一定是一个化合物谱一致，不一定是一个化合物。 应用：应用：确定平

34、面的确定平面的结构骨架结构骨架，立体结构的构，立体结构的构型、型、构象。构象。三、未知化合物三、未知化合物 多种谱学结合的结构解析多种谱学结合的结构解析 1.紫外光谱紫外光谱(Ultraviolet spectra UV)OOCH3OHHOH3COOCH3OH137887993156562. 红外光谱红外光谱(Infrared spectra IR) 为结构解析提供的信息为结构解析提供的信息 提供各种官能团的信息提供各种官能团的信息 八大区（复习）八大区（复习） 如：芳香环如：芳香环: 1600-1480cm-1， OH: 3000 cm-1, C=O : 1700 cm-1. IR相同者为同

35、一化合物相同者为同一化合物.3425缔合羟基1769酯羰基IRIROOOH3COOHOCH3OOOOHHOHOOOOHHOHOOH3.质谱质谱(Mass spectra MS)为结构解析提供的信息为结构解析提供的信息 给出分子量给出分子量(M+), 给出基团或片段信息给出基团或片段信息, HR-MS可计算分子式可计算分子式;MS图一致图一致(同一型号仪器同一型号仪器,同一条件同一条件)一般为同一一般为同一化合物化合物。类型类型 EI-MS: 醇、糖苷不能给出分子离子峰醇、糖苷不能给出分子离子峰; FD-MS、FAB-MS、ESI-MS ：用于糖苷用于糖苷,肽肽,核酸类核酸类,可确定分子量。可确

36、定分子量。 HR-MS：给处精确的分子量和分子式。给处精确的分子量和分子式。M+Na+M+K+M-H-ESI-MSHR-ESI-MSC33H40O18 =12M+Na+为结构解析提供的信息为结构解析提供的信息 化学位移化学位移: (用于判断用于判断H的化学环境的化学环境 chemical shift); 偶合常数偶合常数: J (Hz) 用于判断用于判断H与与H的关系的关系 coupling constant) 积分强度积分强度(积分面积积分面积): 确定确定H的数目的数目.4. 核磁共振谱（核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.1 质子谱（质子谱（1

37、H-NMR）J8.0Hz 存在偶合存在偶合4. 核磁共振谱（核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.1 质子谱（质子谱（1H-NMR）常见基团的化学位移常见基团的化学位移 值值: Ar-H ：6-8, -CHO ：9.8 -CH3 ：1-1.5, C=C-CH3, COCH3, ArCH3 ：1.9-2.5 -OCH3 ：3.5-4.0, -COOCH3与与ArOCH3 ：3.7-4.0影响化学位移因素影响化学位移因素 化学位移值与化学位移值与电子云密度电子云密度有关。电子云密度有关。电子云密度降低降低, ,去屏蔽作用增强去屏蔽作用增强, ,向向低场位移

38、低场位移, , 增大增大。 1 1）诱导效应）诱导效应 2 2）共轭效应）共轭效应 3 3）磁各向异性效应）磁各向异性效应 4 4）氢键缔合）氢键缔合 5 5）范德华效应）范德华效应4. 核磁共振谱（核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.1 质子谱（质子谱（1H-NMR）.偶合常数偶合常数(J) a.偶合裂分是有原子核引起的偶合裂分是有原子核引起的,通过化学键传递通过化学键传递; b.相互偶合的相互偶合的H核其核其J值相同值相同; c.一级图谱峰的裂分遵循一级图谱峰的裂分遵循n+1规律规律; d.归属归属H核核,判断排列情况判断排列情况.l偶合分类偶合

39、分类 偕偶偕偶(Jgem)又为同碳偶合又为同碳偶合 sp3 J=10-15Hz; sp2 C=CH2 J=0-2Hz, N=CH2 J=7.6-17Hz4. 核磁共振谱（核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.1 氢谱（氢谱（1H-NMR）邻偶邻偶(Jvic) 饱和型饱和型: 自由旋转自由旋转J=7Hz 构象固定构象固定: 0-18Hz,与两面角有关与两面角有关,J90=0Hz, J180 Jo (7.5Hz); 烯型：烯型：Jcis =6-14Hz(10), Jtrans=11-18Hz(15) 芳环芳环: Jo=6-9Hz,.远程偶合远程偶合: 如烯

40、丙偶合如烯丙偶合 J4=0-3Hz，苯环的间位苯环的间位Jm=1-3Hz和对和对位偶合位偶合Jp=0-1Hz偶合分类偶合分类4. 核磁共振谱（核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.2 碳谱（碳谱（13C-NMR）为结构解析提供的信息为结构解析提供的信息化学位移：碳处的化学环境化学位移：碳处的化学环境峰高或峰面积峰高或峰面积: :一般不与碳数成正比一般不与碳数成正比4. 核磁共振谱（核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.2 碳谱（碳谱（13C-NMR）常见一些基团的化学位移常见一些基团的化学位移 值值: 脂肪脂肪

41、C: 50 连杂原子连杂原子C: C-O,C-N,C-S :50-100 C-OCH3 : 55; 糖端基糖端基C : 95-105 芳香碳芳香碳,烯碳烯碳: 98-160 连氧芳碳连氧芳碳 : 140-165 C=O: 168-220 C=O: 168-220 醛醛CHO： 190205 酮酮： 195220 羧酸羧酸： 170185 酯及内酯酯及内酯： 165180 酰胺及内酰胺酰胺及内酰胺: 165180 a 全氢去偶谱全氢去偶谱(COM)或或噪音去偶谱噪音去偶谱(PND)或或质子宽带去偶谱质子宽带去偶谱(BBD) 特点特点: 图谱简化图谱简化, 所有信号均呈单峰所有信号均呈单峰. b

42、偏共振去偶谱偏共振去偶谱(OFR) 特点特点: 由于部分保留由于部分保留1H的偶合影响的偶合影响,可识别可识别伯、仲、叔、季碳。伯、仲、叔、季碳。 CH3, q， CH2, t， CH, d， C, s。4. 核磁共振谱（核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.2 碳谱（碳谱（13C-NMR） 常见的常见的13C-NMR谱的类型及二维谱谱的类型及二维谱BBD练习：练习： 一化合物，分子式为一化合物，分子式为C6H14，高度对称，在噪音去高度对称，在噪音去偶谱（偶谱（COM）上只有两个信号，在偏共振去偶谱上只有两个信号，在偏共振去偶谱（OFR）上只有一个四

43、重峰（上只有一个四重峰（q）及一个二重峰及一个二重峰(d)，试写出其结构试写出其结构 .常见的常见的13C-NMR谱的类型及二维谱谱的类型及二维谱 c. DEPT谱谱特点：特点：不同类型不同类型13C信号呈单峰分别朝上或向下信号呈单峰分别朝上或向下,可识别可识别CH3，CH2，CH，C.脉冲系列脉冲系列 =135CH3, CH , CH2 （常用常用） =90CH , =45CH3, CH2 , CH , 季碳季碳不出现不出现4. 核磁共振谱（核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.2 碳谱（碳谱（13C-NMR）DEPT谱谱135 =135CH3, C

44、H , CH2 90CH .常见的常见的13C-NMR谱的类型及二维谱谱的类型及二维谱v1H-1H COSY(相互偶合的氢核给出交叉峰相互偶合的氢核给出交叉峰)vNOESY(空间相近的氢核的关系空间相近的氢核的关系)vHMQC(13C-1H COSY) 13C,1H 直接相关谱直接相关谱1JCHvHMBC(远程远程13C-1H COSY) 13C,1H 远程相远程相关谱关谱 2JCH, 3JCHHMBC化合物 C-17 白色油状物（CHCl3-MeOH），氯仿，丙酮中溶解度好。 TLC: 石油醚:丙酮(3:1) , Rf值约为0.2；氯仿:甲醇(7:1), Rf值约为0.4；有强暗斑， 10硫

45、酸-乙醇显棕色。 FeCl3-K3Fe(CN)6反应(+) 1550cm-11380cm-1C-17 6.78(2H, d, J = 8.1 Hz)OHCH2CH2 3.21 (2H, t, J = 7.5 Hz)OHCH2CH2XC-17OHCH2CH2X76.732.6154.9129.9115.8127.7练习练习: 一天然产物一天然产物A为淡黄色针状结晶为淡黄色针状结晶,紫外灯下紫外灯下(254nm)呈暗斑呈暗斑, FeCl3显兰色显兰色. 1H-NMR (CDCl3, TMS): 9.83(1H,s), 7.43(1H, dd, J =8.5, 1.5Hz), 7.26(1H, d,

46、 J =1.5Hz), 7.04(1H, d, J = 8.5Hz), 3.97(3H, s, OCH3) 13C-NMR (CDCl3): 190.9, 151.6, 147.1, 129.9, 127.6, 114.3, 108.7, 56.1. HREIMS示分子式为示分子式为C8H8O3. 推测结构。推测结构。答案：答案：CHOOHH3CO5. 旋光谱和圆二色散光谱（旋光谱和圆二色散光谱（ORD and CD）(Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism) 旋光谱旋光谱(ORD)和圆二色谱和圆二色谱(CD,需对紫外可见光有吸需对

47、紫外可见光有吸收收)在解决在解决手性中心手性中心附近有附近有生色团生色团(含通过化学转换可变含通过化学转换可变成生色团的化合物，如成生色团的化合物，如-OH、C=O)的化合物的的化合物的绝对构绝对构型或优势构象型或优势构象的。的。 当平面偏振光通过手性中心时，左旋圆偏光和右旋当平面偏振光通过手性中心时，左旋圆偏光和右旋圆偏光的折射率、传播速度，当再合成平面偏振光时，圆偏光的折射率、传播速度，当再合成平面偏振光时，偏振面就发生了旋转，这就是产生旋光的光学原理。偏振面就发生了旋转，这就是产生旋光的光学原理。随着波长变短，折射率差值增大，比旋度增大。随着波长变短，折射率差值增大，比旋度增大。 在不同

48、波长下测定物质的比旋度，以比旋度为纵坐标，在不同波长下测定物质的比旋度，以比旋度为纵坐标，波长为横坐标做图，该图称为波长为横坐标做图，该图称为ORD谱。谱。ORD谱的分类谱的分类 (1). 平坦谱线平坦谱线 无峰无谷，有旋光性，但手性中无峰无谷，有旋光性，但手性中心附近无生色团。心附近无生色团。 正平坦曲线正平坦曲线: 随波长短移比旋度增大随波长短移比旋度增大负平坦曲线负平坦曲线: 随波长短移比旋度减小随波长短移比旋度减小 (2). 单纯单纯Cotton曲线曲线 有峰有谷，手性中心附近有生色团。有峰有谷，手性中心附近有生色团。正正Cotton曲线曲线: 长波长波 短波，先峰后谷短波，先峰后谷负负Cotton曲线曲线: 长波长波 短波，先谷后峰短波，先谷后峰