DNA提取个步骤作用原理

1、质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上， 随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒 DNA 的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒 DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法， 其基本原理为： 当菌体在 NaOH和 SDS溶液中裂

2、解时，蛋白质与 DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒 DNA 分子能 够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA 不变性 而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒 DNA 的方法通常是利用了质粒DNA 相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化钳-漠化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA ,经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀 等简单步骤去除残余蛋白质和RNA ,所得纯化的质粒 DNA 已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。一、试剂

3、准备1,溶液 I : 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0) , 10mM EDTA(pH8.0 )。1MTris-HClt1 (pH 8.0) 12.5ml, 0.5M EDTA ( pH8.0) 10ml，葡萄糖 4.730g,加 ddH2O 至 500ml。在 10 lbf/in2 高压灭菌 15min ,贮存 于 4Co 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和适当pH值的 Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以

4、说溶液 I中葡萄糖是可缺的。EDTA 呢？大家知道 EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属 离子的螯合剂，配 在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I中加入高达 10 mM的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所 有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA,其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕 DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的 TE缓冲液中有 EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或 LB 培养基来悬浮菌体就可以了。这是用新鲜的 0.4 N

5、 的 NaOH 和 2%的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH 稀释 制备 0.4N 的NaOH，无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了碱 性。 很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS,所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在 瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer (双层膜)结构向 micelle (微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下)，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS当然

6、也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH 的作用误以 为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组 DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂 会带来麻烦。3.溶液 m：醋酸钾（KAc ）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml ,冰醋酸

7、 57.5ml,加 ddH2O 至 500ml。4 C保存备用。溶液 III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的 误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往 1%的 SDS溶液中加如 2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与 SDS的加入有关系。如果在溶液 II中不加 SDS 会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1%的 SDS溶液中慢慢加 入 5 N 的 NaCl，你会发现 SDS在高盐浓 度下是会产生沉淀的。因此高浓度的

8、盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是 KCl ,你会发现沉淀的量 要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate ）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（ potassium dodecylsulfate, PDS ）, 而 PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液 III加入后的沉淀实际上是钾离 子置换了 SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS 分子，钾钠离子置 换 所 产 生 的 大 量 沉 淀 自 然 就 将 绝 大 部 分 蛋 白 质沉

9、淀 了 ， 让t3人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被 PDS给共沉淀了，尽 管 SDS并不与 DNA 分子结合。1. 为什么用无水乙醇沉淀 DNA ?用无水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA 的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此是理想的沉 淀剂。 DNA溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般实验中，是加 2倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合， 其乙醇的最终含量占

10、 67%左右。因而也可改用 95%乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙 醇的价格远远比 95%乙醇昂贵）。但是加 95%的乙醇使总体积增大，而 DNA 在溶液中 有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA 时可用 95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置 15 -30分钟即可。2. 在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.10.25mol/L ? 在 pH为8左右的溶液中，DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaA

11、c 或 NaCl,使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的 DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗 涤或重沉淀8.1ml 预冷的 70%乙醇洗涤沉淀 1-2次，4C离心 8000g 7min ,弃上清，将沉淀在室温 下晾干。9.沉淀溶于 20卬 l TE(含 RNase A 20卬 g/网 37 C水浴 30min 以降解 RNA 分子

12、，-20 C 保存备用。三、质粒 DNA 的电泳检测观察琼脂凝胶中 DNA 的最简单方法是利用荧光染料漠化乙锭进行染色。构建目的基因的真核表达载体目的：构建目的基因的真核表达载体历时整整一学期，期间经历了很多挫折，遇到很多问题，也从中学到很多经验.借寒假的时间写了写我一学期构建的经历，把我的一点经验拿出来和大家分享讨论.分步来说：一.PCR扩增得到目的片段1.引物的设计与合成：这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错(此上游引物 40个碱基)，后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次送了五个克隆测序，三个是上游引

13、物出错，两个是正确的克隆，60%的出错率。现在想想，有几点教训：尽量避免长引物的合成。越长意味着出错的几率越大，哪家公司都这样(2)选择一家质量可靠的公司，千万别在这省钱，引物再贵也花不了多少钱，可一轮构建下来，一测序发现引物错了，不知白扔了多少钱不说，那种心情实在是难以收拾(3) 一旦发现引物有问题，及时换公司，我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过，结 果还是错，时间咱耽误不起2. Pfu酶扩增：(1)扩增效率低的问题：往往 taq酶扩的很好，一换成 pfu就是扩不出来。解决办法：a延长延伸时间(我 1.2kb用 3分 15秒才扩出来)，并适当增加循环数；b多试几家的 pfu,总有一家能扩

14、出来；c 多设计几对 引物试试，总有一对能扩出来，因为 pfu有外切活性，可否适当的延长引物的3互补端；d构建中间载体：一旦用某一对引物能扩出来，把此目的片段连接t-easy 中间载体，测序正确后，即可以此中间载体做pcr扩增的模板。实践证明以此中间载体为模板的pfu扩增效率远远高于以 cDNA 为模板。(2)pfu保真性的问题：即使是 pfu ,也会出错。现在各家公司都有号称高保真的pfu酶出售，价格不一。虽然都是pfu,但质量不不见得一样，在都能扩增出来的情况下，选择信誉好的公司的pfu。我用的是一家小公司的 pfu,很便宜，100u 才 80块钱，但我 1.2kb的片段却频频出错。所以万

15、不可 在酶上省那百十块钱，最后花了大钱不说，还浪费了时间精力。3.cDNA 模板的问题：在 pfu摸条件这一步往往要耗费大量cDNA 模板，因此在开始要准备足够的cDNA。100ul,200ul都不为过。新提取的 RNA证明很好的话，就再多逆转录几管，我的 RNA 在80 C 放 了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。当然这其中可能有很多原因，酶的问题，RNA的降解等等，但是当你做 PCR 做到很烦的时候，发现 cDNA 模板不够了，又重新养细胞提 RNA 是一件非常痛苦的事情。二. 酶切的问题：用于构建的酶切一定要非常充分！ 新买回来的酶要分装，用于“酶切后回收”和“酶切鉴定”的酶要分开。因

16、为用于“酶切鉴 定”时，只要能切出来就行了，而用于“酶切后回收再做连接”的酶一定要保证切的充分， 才能提高连接效率，更重要的是减少筛选时的麻烦！ 我有一段时间连挑了三十多个克隆都是空载体，当然一方面怪我没有做载体自连的阴性对照，及时发现这一问题， 另一方面酶反复从冰箱拿出来活性下降酶切效率降低，导致大量的载体自身连接。我觉得内切酶这东西还是挺娇气的，所以还是建议大家新酶分装， 用于“酶切鉴定”的可稍放松，用于“酶切后回收” 的酶一定要尽量减少冻融次数，并尽量减少在室温放置的时间。三. PCR 产物直接酶切：我设计引物时保护碱基时随意的在酶切位点两侧加上了两三个g 或者 c 的组合，做到后来才知

17、道加保护碱基也是有说法的，不同的保护碱基会影响酶切的效率。以我随意加上的保护碱基，理论上酶切效率将极低。但做下来，前后酶切了四条不同的PCR 产物，我并没有再这一步上遇到问题，我一般 37C切 30到 35个小时，酶切效率都不错。可见关于保护碱基的 问题并不是那么绝对。四. 连接：再这一步上我最深刻的教训就是关于做对照的问题。第一次酶切的载体做载体自连的阴性对照，仅长出了几个克隆。 为了省事，以后都省去了这一步。有两周，我连续做了两轮酶切连接筛选，总共挑了三十多个克隆，居然全是空载体！ 这时再补一个载体自连对照，满板子都是菌落。再换两支新酶重新切载体，回收后再自连， 板子上仅有几个菌落。为了省一点小事费了大力气，后悔莫及。从此以后，认认真真做对照。另外，关于连接，我是用电泳的方法大概确定载体和目的片段浓度，然后一 1 : 5-8左右的