免疫亲和萃取技术应用举例

1、蓝色海洋书的海洋免疫亲和萃取技术应用举例 一、环境水样中多环芳烃(pahs)的免疫亲和萃取 pah、是斯德哥尔摩公约规定的主要环境持久性有机污染物之一。欧盟规定6种主要的pahs(荧蒽，苯并b荧蒽，苯并k荧蒽，苯并a芘，苯并ghi，茚并芘)在饮用水中的总浓度不得超过0.2ug·l-1。pahs具有易挥发性和憎水性两大特点。因为它的僧水性，它在水中的浓度很低，普通为ug·l-1，因此需要敏捷的检测办法，并对样品举行浓缩和富集。因为它的挥发性，在浓缩和富集过程中应避开用法蒸发溶剂的办法，以免分析物的损失。应用免疫萃取技术可以很便利地实现这类化合物的浓缩和富集。由perez等建立

2、的水样中pahs的免疫萃取办法如下：首先，依次用缓冲液和水平衡免疫亲和柱；然后，使一定体积的过0.45um滤膜的水样通过免疫亲和柱，为避开pahs在管壁上的吸附，在样品中加入了10的，接下来用水溶液冲洗，洗掉非特异性结合的杂质；最后，用50的乙腈水溶液洗脱，洗脱液进入c18分析柱而被捕集在柱顶端。洗脱一定时光后，梯度增强流淌相中的浓度，pahs在c18柱上得以分别。因为这种办法可以对大量样品举行在线富集与纯化，所以用法相对检测敏捷度较低的dad检测器即可达到检测要求。并且可以再按照保留时光定性的同时，依据各峰对应的紫外谱图对化合物的结构进一步确认，这对于分析pahs这类复杂化合物十分须要。二、

3、土壤样品中阿特拉津及代谢产物的免疫萃取土壤中除草剂及其代谢产物的检测对于讨论除草剂在环境中的降解及转化具有重要意义。普通而言，农药的降解过程是极性增加的过程。因此，用传统办法从土壤中萃取除草剂及其代谢产物时，会同时萃取出大量的胡敏酸和富里酸等极性有机物。这些有机物有时会极大地干扰分析物的测定。8-12 (a)所示，用传统溶剂萃取办法萃取土壤样品中的阿特拉津及其代谢产物，用非挑选性吸附剂(plrp-5)并用lc-dad举行分析，一可以看到谱图上有许多杂峰及大的峰丘存在，阿特拉津的代谢产物经基阿特拉津(oha)在谱图上几乎被峰丘彻低笼罩。而用免疫亲和柱举行净化后，8-12 (b)所示，绝大多数杂峰

4、及峰丘被去除，阿特拉津及其代谢产物脱乙基阿特拉津(dea)和经基阿特拉津在谱图上有十分清晰的峰，彻低可以被定量检测。用免疫萃取办法从土壤中萃取日标化合物普通采纳离线模式，需要经由三步操作。首先，同传统溶剂萃取办法一样，挑选合适的溶剂，将目标化合物萃取到溶剂中；然后，用减压蒸馏等办法去除等有机溶剂，用缓冲液稀释；最后，通过免疫亲和柱举行免疫萃取与净化。采纳类似的办法，也可以对食物样品(如：土豆、萝卜等)中的农药残留举行萃取与净化，同样达到了令人惬意的效果。三、工业废水中染料及中间体的免疫萃取联苯胺和是纺织和印染工业废水中频繁的剧毒污染物。由干废水中其他极性基质的干扰，利用传统非挑选性萃取办法对这

5、几种化合物举行萃取与净化不但费时费劲，而且难以达到令人惬意的效果。而用法免疫萃取办法则可以十分容易地解决这一难题。bouzige等用联苯胺抗体制备的免疫亲和柱讨论了从纺织工业废水中萃取氨基偶氮苯及其他偶氮类染料的可行性。他们首先取2.5ml纺织工业废水，向其中加入47.5ml磷酸盐缓冲液，在稀释后的溶液中添加1ug·l-1的联苯胺、3,3'-二氯联苯胺和。然后将此溶液分离通过一个非挑选性的固相萃取柱(prp-1)和免疫亲和柱，最后将洗脱液用hplc举行分析，色谱图分离8-13 (a)和(b)所示。可以很显然地看出，因为基体的干扰，用prp-1萃取后的溶液中，联苯胺和4-氨基偶

6、氮苯无法检出，而经过免疫亲和柱的挑选性萃取后，绝大多数干扰物被去除，上述三种化合物可以在色谱图上显然检出(4-氨基偶氮苯峰很低的缘由是其在287nm的检测波长下汲取很小)。这解释，免疫萃取办法可以从基体复杂的工业废水中挑选性地萃取目标化合物，从而可以有效地避开一些极性相近的基质对分析的干扰。四、真菌毒素的免疫萃取真菌毒素的免疫萃取是应用最多，进展最成熟的免疫亲和萃取技术。目前市场上商业化免疫亲和柱绝大多数集中于黄曲霉毒素、储曲霉毒素、伏马毒素等真菌毒素，其中黄曲霉毒素免疫亲和柱用量最大。无数真菌毒素的免疫萃取办法已被权威机构认定为标准检测办法。例如我国现行国标检测力一法：gb/t 18979-

7、2003食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法，gb/t 30955-2014饲料中黄曲霉毒素b1、b2、g1、 g2的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法，gb 5413.37-2010食品平安国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素m1的测定等均采纳了免疫亲和柱举行样本前处理。图8-12 用固相萃取剂plrp-5和免疫亲和吸附剂萃取阿特拉津及其代谢产物dia-脱异丙基阿特拉津；dea-脱乙基阿特拉津；oha-羟基阿特拉津；atrazrne-阿特拉津图8-13 用固相萃取剂prp-1和免疫亲和吸附剂从工业废水中萃取偶氮苯类化合物1-联苯胺；2-3,3'-氯联苯胺，3-

8、4-氨基偶氮苯因为讨论比较成熟，因此真菌毒素免疫亲和萃取技术的一些讨论阅历可以为其他环境污染物的免疫亲和萃取技术开发提供参考。例如，免疫亲和萃取对于样品基质干扰的去除效果，免疫亲和萃取条件对萃取回收率的影响，免疫亲和萃取条件对亲和柱重复用法性能的影响等。对于高脂肪含量样品中目标物的提取回收率及脂肪对免疫反应的干扰是导致这类样品检测结果精确性差的重要缘由。roberts j等开发的可可豆中储曲霉毒素a的免疫亲和萃取-hplc办法可以为解决这类问题提供参考。他们首先用1的溶液(ph 10)对样品举行超声萃取，然后加入一种絮凝剂举行脱脂，净化处理后的样品挺直举行hplc检测。该办法经延续4年添加回收

9、评估，回收率稳定在89105，变异系数cv10。为克服传统免疫亲和萃取技术单次处理成本高，消耗溶剂多，操作时问长，对操作人员阅历及前处理仪器要求高等缺陷，es' haghi等将黄曲霉毒素抗体固定在石墨烯修饰的磁性纳米颗粒上，用于萃取大米、小麦、芝麻等样品中的b1、b2、g1及g2。样品经磁力分别及洗涤后，用hplc检测。因为磁性载体材料价格廉价，分别设备容易，试剂用量少，因此可以大大降低黄曲霉毒素检测的成本。五、多残留免疫萃取多残留免疫萃取是近年来免疫亲和萃取的热点。实现多残留免疫萃取的路途主要有三种。一种是将不同的免疫亲和萃取柱串联，样品依次流过不同亲和柱，每一亲和柱挑选性吸附对应待

10、测物。其次种路途是在同一亲和柱中装填偶联不同抗体的填料，从而实现对不同目标物的免疫萃取。第三种路途是开发具有“组识别”能力的抗体，即抗体能够和某一类化合物结合，从而实现对一类待测物的同时萃取。按照在样品中同时浮现的可能性，多残留免疫亲和萃取多应用于真菌毒素或抗生素的同时萃取。多残留萃取有两个主要挑战，一是如何有效把极性不同的目标物有效萃取，二是如何保证目标物在免疫亲和柱上有效保留。lattanzio等利用vicam公司的myco6inl+ tm多残留亲和萃取小柱和液相色谱电喷雾离子化串联质谱(lc/est-ms/ms)联用，建立了玉米中黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素

11、g2、储曲霉毒素a、伏马毒素b1、伏马毒素b2、呕吐毒素、t-2毒素和ht-2毒素等11种真菌毒素的多残留分析办法。为应对前面所述多残留分析的两个挑战，本文采纳了两步法，即首先采纳溶液萃取，其后采纳甲醇萃取。并且水相和有机相提取物依次实行亲和萃取操作，囫囵过程约消耗120min。操作如此繁琐的主要缘由在于免疫亲和柱所用的呕吐毒素抗体在有有机溶剂存在的条件下对呕吐毒素的亲和力削弱，从而使呕吐毒素在柱上的保留能力降低。2013年左右，vicam公司采纳了对有机溶剂耐受性更强的don抗体，使得免疫亲和小柱的有机溶剂耐受性提升，从而大大削减了样品前处理时光和简化了操作。2014年，lattanzio vm试验室报道了利用该真菌毒素多残留小柱改进后的免疫亲和萃取-lc-ms/ms办法。该办