高胰岛素正葡萄糖钳夹技术在比格犬中的建立董立厚样本

1、高胰岛素-正葡萄糖钳火技术在比格犬中的建立及应用董立厚，宋海峰（军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100851）【摘要】目的：在比格犬中建立高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术。方法：以5只健 康比格犬为实验对象进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验，考察血糖、胰岛素、C 肽及胰高血糖素等指标。结果：成功将血糖控制在目标水平,变异系数小于5%; 实验过程中血清胰岛素最后稳定在 40.0 ± 3.8 ml U- L-1,显著高于基础胰岛素 水平；血清C肽浓度显示内源性胰岛素受到了明显的抑制，胰高血糖素没有显 著升高。结论：在比格犬体内建立高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术，并将其成功用 于胰岛素制剂药效动

2、力学的评价。【关键词】：高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术；药效动力学；比格犬The euglycemic clamp technique was established in beagle dogsAbstract Objective:To establish euglycemic clamp technique in beagledogs. METHODSThe euglycemic clamp technique was applied in healthybeagle dogs and the blood glucose, insulin, C-peptide , insulin and gl

3、ucagon were monitored during the clamp period . RESULTS: The blood glucose level was controlled within the basal level, coefficient of variation being less than 5% during the clamp period. The serum insulin concentration finally reached to the level of 40.0 ± 3.8 mIU L-1 stably and a significan

4、t inhibition was showed in endogenous insulin by the determination of C-peptide. But there was not significant increase ofserum glucagon compared with basal values. CONCLUSIONSMethodology confirmed that the euglycemic clamp technique is successful in beagle dogs【作者简介】董立厚（1979 -）,男，河北渭河县，博士研究生，研究方向：生

5、物技术药物药代动力学通讯联系人，宋海峰，Tel: （010）66930259 and can be applied in study of pharmacodynamics of insulin preparations. KEY WORDSeuglycemic clamp technique; pharmacodynamics; beagle dogs高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术1由于定量准确、可重复性好、避免低血糖等优点，已成为胰岛素敏感性评价的金标准2。近年来该技术已扩展应用于胰岛 素制剂药代动力学及药效动力学评价方面3-6 ,但当前国内在此方面应用的报道 较少，特别是在比格犬中的应用还未

6、见报道。国外文献对于该方法也只有概略性 的描述，没有提供方法质控的指标。本实验旨在归纳总结现有文献报道，将该技 术细节及技术指标进一步明确，以利于该技术在比格犬中的应用。1材料与方法1.1 动物健康比格犬5只，体重12 土 2 kg,军事医学科学院动物中心产。动物生 产许可证号：京动SCXK? 0046591号。分笼，用比格犬标准饲料饲养，定时通 风、光照，自由饮水。在实验前一周将其悬吊在巴甫洛夫吊带内进行适应性训 练。1.2 药品及试剂受试药品：皮下注射用常规胰岛素：江苏万邦生化股份有限公司生产，批 号0412A10,在无菌条件下溶解于含0.2 %的白蛋白注射用水中。猪胰岛素测定采用美国R&

7、amp;D SYSTEMS司产 Quarantine? IVD? humanErythropoietin ELISA试剂盒测定；C肽放免试剂盒及胰高血糖素放免试剂盒（由解放军总医院免疫实验室提供并检测）。1.3 仪器艾美达nVP5005输液泵（瑞士艾美达生产）；艾美达nSF5005注射泵（瑞士艾美达）；强生血糖仪（稳豪型,美国强生公司）；Microscan MK2 全自动酶 标仪（芬兰Labsystem公司）。1.4 方法1.4.1 高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术的建立比格犬禁食14-16 h后，用巴甫洛夫吊带固定在实验架上。在比格犬一侧前肢建立静脉输注通道，该通道连接三通管，一端连接胰岛素注射泵

8、，一端连接 葡萄糖输注泵；在另一前肢穿刺并留置导管作为取血通道测量血糖，用电热毯包裹加热，将其温度控制在45-55 C左右以使静脉血动脉化7。待比格犬安静30 分钟后，连续测定3次基础血糖，每次间隔10分钟，待血糖稳定后，将目标血 糖设为基础血糖水平。首先快速输注胰岛素 （8 mU kg1 min-1）迅速将胰岛素 提高到较高的浓度水平,以抑制内源性胰岛素的分泌，然后逐渐降低速度，大 约10min后血糖下降，将胰岛素输注速度设定为 0.8 mU - kg-1 min18,9。问隔 5min测血糖，根据血糖调节葡萄糖输注速度，调节血糖在目标范围内，避免低 血糖引起神经内分泌反应。并分别于0、10

9、、30min, 1、1.5、1.75、2 h取血并检测胰岛素及C肽的血清浓度。钳夹结束时，首先停止泵入胰岛素，预防 低血糖发生。然后逐渐减少葡萄糖输入速度。实验血液样品均经离心分离血清后 置于-20 C保存待测。1.4.2 血清胰岛素、C肽及胰高血糖素的检测应用放射免疫分析（RIA）方法检测血清样品中胰岛素、C肽及胰高血糖素的浓度。1.4.3 结果计算及统计方法计算各比格犬24次血糖值的均数（X）和标准差（S），再按S/X计算血糖变异 系数。本实验采用自身配对试验设计，基础状态与钳夹稳态期比较采用配对t检验O2结果2.1 血糖水平5只比格犬的基础血糖水平为4.0 ± 0.1 mM L

10、-1。钳夹建立后，5只比格犬 由于个体差异导致葡萄糖输注率（GIR）差异较大，但血糖均迅速达到目标水 平。钳火达到平衡后，5只比格犬的血糖水平为3.9 ± 0. 1 mM- L-1,与基础状态 无统计学差异（p>0.05） o实验过程中，由于外源性胰岛素输入导致动物血糖下 降及葡萄糖输注速度调节的延滞性，造成钳火建立过程中有个别时间点血糖浓 度稍低于目标水平。但整体血糖水平都控制在目标范围内，血糖变异小于5%1020一 一GIR8 6 4 2 0 平水糖血204080图1比格犬在钳夹建立过程中血糖及GIR-时间曲线2.2 葡萄糖输注率外源性胰岛素在钳火实验开始后前10分钟的迅速

11、输注，体内外源性胰岛素 水平迅速升高，在15分钟后开始发挥降糖作用，葡萄糖输注率在钳夹实验开始 15分钟后也相应迅速增加。35 min达峰后呈缓慢降低趋势,于90120 min趋于稳 定,最后固定在 7.3 ± 0. 7 mg kg-1 min-1。2.3 比格犬血清胰岛素5只比格犬基础胰岛素浓度为5.8 ± 0.4 mIU- L-1。从5只比格犬血清胰岛 素抗原C-T曲线中可见，由于前10 min胰岛素输注速度很快,至10 min后血清 胰岛素抗原浓度迅速升高至170.5 ± 15.3 ml U-L-1左右，然后随着输注速度降 低而下降，1.52 h后钳火形成，

12、胰岛素浓度基本处于稳态，约为40.0 ± 3.8 mu- l-102.4 比格犬血清C肽血清中C肽能够反映内源性胰岛素分泌情况。比格犬的基础C肽浓度为0.24 ± 0.04 g - L-1;钳夹实验开始后，C肽浓度逐渐降低。1.52 h钳夹建立后，各 时间点的C肽浓度为0.09 ± 0.0 3 g - L-1,较比格犬的基础C肽水平显著降 低（P<0.01）,抑制程度在60流右。1L g肽C图2比格犬在钳火建立过程中平均胰岛素及C肽的浓度-时间曲线2.5 比格犬血清胰高血糖素钳火稳态期与基石犬态相比较，胰高糖素的水平无显著性差异 （70 vs 64.-1、p

13、g - mL）。3应用实例本实验室利用该技术对比格犬给予不同胰岛素制剂后的药效动力学性质进 行了评价（见图3与表1）。实验结果明确阐明了两种不同胰岛素制剂在比格犬 中的药效动力学性质差异，使人们对两种胰岛素制剂的特征有了深入的认识 从而为药物的临床应用奠定基础。20n ,mgg io .mRG0 -0120240360480600Time/min图3高胰岛素-正葡萄糖钳火技术在比格犬给予不同胰岛素制剂后平均GIR-T曲线表1比格犬给予不同胰岛素制剂后各组药效动力学参数的比较（n = 10）参数口服胰岛素（16 U）注射胰岛素（5 U）T Effect(min)48右823 ±11T

14、max(min)265烧151 右5GIRmax (mg/kg/min)6.9 2.214.0 3.2GIR-AUC (0-600) ( mg/kg)2735 ±11524747 J8974讨论高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术的优点在于经过向受试对象输注外源性葡萄糖 及胰岛素，打破了体内葡萄糖-胰岛素的负反馈调控，将血糖浓度控制在正常水 平，从而将血糖波动造成的神经、激素等内源性干扰降到最小，增加了实验的 可重复性与准确性。高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术关键在于维持血糖平衡，对外源性葡萄糖输注 速率的调节要求很高。从实验数据分析认为外源性葡萄糖从进入血液到分布平衡 需要510分钟，而实验中我们

15、是每隔5分钟进行一次血糖调节，因此在调节血 糖时，5分钟前血糖调节的结果还没有完全显现出来。这就要求在实验中，不要急于调节当前血糖水平,要”瞻前顾后”，采用微调手段，避免血糖产生较大的 波动。要研究单位糖提高血糖水平以及糖浓度随时间变化，从而为实验中血糖的 调节提供预判。本实验在钳夹建立后血糖也控制在 5犯内，和国外文献网报道结 果相似。而在胰岛素药效动力学评价过程中血糖变异系数有所增加，但也低于8%,表明血糖控制在相对稳定的范围内。在高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术建立过程中，内源性肝糖产生是否被抑制是 正糖钳夹技术建立的一个关键点，这也是高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术的局限所 在，如需进一步了解肝糖产生情况则需要采用扩展葡萄糖钳夹技术10，11。但有文献报道当血浆胰岛素浓度水平明显高于生理水平时,正常人肝糖的输出可完全被抑制。临床研究表明，无论是糖尿病患者还是其它有严重IR