拉米呋啶治疗后乙肝病毒聚合酶YMDD的变异【临床医学论文】

1、临床医学论文-拉米呋啶治疗后乙肝病毒聚合酶YMDD的变异            王亚文，马列婷，惠凌云，谭巩诚，胡志国，王富中 【关键词】  拉米呋啶；乙肝病毒；YMDD变异摘要：目的  观察拉米呋啶治疗慢性乙肝患者1年前后，患者体内HBV DNA多聚酶结构域C的酪氨酸甲硫氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸(YMDD)基因变异情况，及其与血清HBV DNA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平及乙肝标志物变化的关系。方法  采用实时荧光定量PCR、ELISA及速率法分别检

2、测60例乙肝患者经拉米呋啶治疗后其血清YMDD、HBV DNA、乙肝标志物及ALT的变化情况。结果 ±±10.1)u/L，两组相比差异有统计学意义(P<0.01)。 5名HbeAg阴转患者无YMDD变异。结论  乙肝患者经拉米呋啶治疗后，YMDD变异率随用药时间的延长可逐渐增加，当其HBV DNA、ALT含量出现明显反跳时，应及早改变治疗方案。关键词：拉米呋啶；乙肝病毒；YMDD变异Mutation of YMDD in hepatitis B virus polymeraseafter lamivudine treatmentABSTACT: O

3、bjective  To investigate tyrosinemethionineaspartateaspartate (YMDD) mutation and the relationship with the levels of HBV DNA, ALT and HbeAg in chronic hepatitis B patients after one year of lamivudine therapy. Methods  The serum YMDD mutation, HBV DNA, ALT and HbeAg levels of 60 patients

4、on lamivudine therapy were detected by FQPCR, ELISA, and rate method, respectively. Results ±±10.1)u/L, respectively. The level of ALT in patients with YMDD mutation was higher than that in the patients without YMDD mutations. There was no YMDD mutation in the 5 patients whose HbeAg r

5、esurned negative. Conclusion  After lamivudine therapy, patients with YMDD mutation showed significant decrease in the level of HBV DNA and ALT. KEY WORDS:lamivudine; hepatitis B virus; YMDD mutation拉米呋啶(lamivudine)是一种能抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制的核苷类药物1，但在长期的用药过程中，部分患者出现耐药。患者体内HBV DNA多聚酶结构域C的酪氨酸甲硫氨酸天门冬氨酸天门

6、冬氨酸(tyrosinemethionineaspartateaspartate, YMDD)基因发生变异2，其变异主要有两种形式：HBV的P基因C区密码子甲硫氨酸突变为缬氨酸(YVDD变异)或异亮氨酸(YIDD变异)。为了探讨YMDD变异对拉米呋啶治疗效果的影响，本研究对60例慢性乙型肝炎患者经拉米呋啶治疗后6月、9月和1年血清标本进行了动态YMDD检测，同时观察其血清HBV DNA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的变化及其与乙肝标志物的关系。1  材料与方法  研究对象  拉米呋啶治疗组：2000年10月至2002年5月在本院就诊的慢性乙肝患者60例，诊断符合

7、2000年第10次全国病毒性肝炎会议修订的标准。HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)、核酸斑点杂交试验阳性(+)，HBV DNA×107，ALT>60u/L。其中男性39人，年龄18-67岁，平均39.8岁；女性21人，年龄21-63岁，平均37.4岁。服用拉米呋啶治疗(100mg/d)1年，于用药后6个月、9个月、1年分别进行血清标本YMDD、HBV DNA含量和ALT水平以及乙肝标志物的动态检测。对照组：同期在本院就诊的慢性乙肝患者30例，诊断标准与治疗组相同。其中男性19例，年龄16-44岁，平均35.8岁；女性11例，年龄18-56岁，平均35.4岁。采

8、用保肝治疗1年，检测YMDD变异。  检测方法  YMDD变异检测  采用实时荧光定量PCR法3。试剂盒购自上海克隆生物高技术，采用美国PE公司ABI 5700 PCR扩增仪检测，操作步骤见试剂说明书。  HBV DNA定量检测  采用实时荧光定量PCR法。仪器同上，试剂购自中山达安基因股份，操作步骤严格按说明书进行。  血清标志物(二对半)测定  采用ELISA法。试剂盒购自厦门新创生物公司。  ALT测定  试剂盒购自德国ROCHE公司，采用速率法。仪器为ROCHE MODULAR800全自动生化分析

9、仪  统计学处理  采用SPSS8.0 软件进行统计学分析处理。YMDD变异组与无变异组HBV DNA阴转率的比较采用2检验，YMDD变异组与无变异组ALT水平的比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果  YMDD变异的发生率  拉米呋啶在用药6、9、12个月后，其YMDD变异发生率逐渐增高，1年后总变异率为13.3%，略低于文献报道4(表1)。  拉米呋啶治疗后HBV DNA水平变化 ××××105 copys/mL。可见拉米呋啶在用药6个月后HBV DNA含

10、量明显降低，且随时间的延长，患者血清中HBV DNA 含量逐渐降低，用药1年后35例患者HBV DNA阴转(表2)。表1  拉米呋啶治疗后YMDD变异发生率（略）Table 1  The occurrence of mutation in patients after treatment with lamivudine表2  拉米呋啶治疗后不同时间HBV DNA含量的变化（略）Table 2  The level of HBV DNA in patients after treatment with lamivudine  YMDD变异与HBV

11、 DNA水平变化的关系  拉米呋啶用药12个月后，其YMDD 变异组与无变异组相比，HBV DNA阴转率明显不同，结果显示变异后HBV DNA含量反跳，阴转率下降。与正常对照相比，拉米呋啶在用药9个月和12个月后，HBV DNA阴转率明显增加(表3)。表3  YMDD与HBV DNA阴转率的关系（略）Table 3  The relationship between YMDD mutation and transnegative ratios of HBV DNA*P<0.01 vs. control  YMDD变异与ALT的关系 

12、77;±±±10.1)u/L， 两组相比均有显着性差异(P<0.05，P<0.01)。YMDD变异组中有3/8的患者出现ALT反跳，即其ALT水平高于治疗前，而无变异者中无1例发生ALT反跳。  HBV血清标志物的变化  治疗12个月时60名患者中有5例HBeAg转阴，3例患者发生血清转换(HBeAg转为HBeAb)，HBeAg阴转的患者中无人发生YMDD变异。3  讨论拉米呋啶具有强力地抑制乙肝病毒复制的作用，可迅速降低患者血清HBV DNA水平。该作用主要是通过抑制HBV多聚酶活性，阻断HBV DNA合成而实现的。拉米

13、呋啶为胞嘧啶核苷类似物，在体内以三磷酸化形式与HBV多聚酶结合后，竞争性抑制了多聚酶活性，造成HBV DNA链合成终止，从而抑制病毒复制。位于多聚酶活性结构域的YMDD基因序列是其结合位点，编码多聚酶的基因的个别核苷酸的变异可改变该结合位点的构象，使HBV可逃避拉米呋啶的作用而产生耐药株。对拉米呋啶耐药的乙肝病毒的主要特征为其酪氨酸甲硫氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸(YMDD)发生氨基酸置换，甲硫氨酸的rt204位点被异亮氨酸(rtM204I)或缬氨酸(rtM204V) 替换。少数患者在服用拉米呋啶年后即在HBV P基因区出现YMDD变异，并伴有血清HBV DNA的反跳和ALT水平的反跳。服药时间越

14、长，发生变异越多。有研究显示，发生YMDD的最早时间可在用药后49d5。国外多项实验证明，16%-32%的患者在用拉米呋啶治疗1年后，发现YMDD变异4，且HBV DNA和ALT水平均高于YMDD野生型患者，进一步证实YMDD变异与HBV DNA及ALT水平异常明显相关，是导致拉米呋啶治疗失败的主要原因6。有文献报道7，少数患者YMDD变异发生在停用拉米呋啶治疗6周后，其原因尚有待进一步研究。一般认为，用拉米呋啶治疗HbeAg阳性患者，血清HbeAg转为HbeAb的转换可以作为停药的标准78。如出现YMDD变异，应调整治疗方案，停药或联合用药。持续使用拉米呋啶治疗9-10个月后，乙肝病毒的RN

15、A依赖的DNA聚合酶(rtM204I/V)发生变异。用药5年后，变异的发生率可达70%以上，并可导致ALT升高及HBV DNA 反跳，严重者可导致失代偿或死亡9。临床观察及组织学研究建议如发生此类现象，停药比继续治疗对患者更有益。本文结果显示，拉米呋啶在用药6个月后HBV DNA水平明显降低，用药1年后(35/60)HBV DNA阴转，与文献报道相近1011。如服用拉米呋啶后患者出现ALT水平持续高于正常，并伴有HBV DNA水平升高，均提示发生YMDD变异，应及早建议患者检测并确立新的治疗方案。对待失代偿和代偿期的YMDD变异的患者可联合或单独使用阿德福韦治疗。阿德福韦rtN236T和A18

16、1V耐药的发生率很低，用药1年、3年后的变异发生率分别为0和5.9%12。总之，拉米呋啶治疗慢性乙肝的疗效是肯定的。但用药过程中应及时检测HBV DNA含量，发现变异后可通过联合用药克服耐药问题，从而达到最佳的治疗效果。参考文献：1Lai CL, Chien RN, Leung NWY, et al. Oneyear trial of lamivudine for chronic hepatitis B J. New Eng J Med, 1998, 339(2):6168.2Jardi R, Buti M, Rodriguez FF, et al. Rapid detection of la

17、mivudineresistant hepatitis B virus polymerase gene variants J. J Virol Meth, 1999,83(12):181187.3Kohmoto M, Enomoto M, Yano Y, et al. Detection of serum hepatitis B virus DNA by realtime quantitative polymerase chain reaction (TaqMan PCR) during lamivudine treatment:comparison with three other assa

18、ys J. Hepatol Res, 2003, 26:125133.4Lia YF, Chien RN, Yeh CT, et al. Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD motif mutation during lamivudine therapy J. Hepatology, 1999, 30(2):567572. 5Ahmed SNS, Tavan D, Pichoud C, et al. Early detection of viral resistance by determination of hepatitis B virus polymerase mutations in patients treated by lamivudine for chronic hepatitis B J. Hepatology, 2000, 32(5):10781088.6Malik AH, Lee WM. Chronic hepatitis B virus infecton: treatment strategies for the next millennium J. Ann Inter Med, 2000,132(9):723731.