RealtimePCR原理及其定量方法

1、实时荧光定量PCR原理及其定量方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理和定量方法原理和定量方法一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR的原理的原理 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧荧光基团光基团，利用荧光信号累积，利用荧光信号累积实现了实现了实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，进程，对对起始模板起始模板进行定量分析的进行定量分析的方法。方法。三个关键词：三个关键词：实时，定量，荧光实时，定量，荧光常规常规PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定量及进行定量及定性分析定性分析定量定量PCRPCR技术：技术：通过对通过对PCRPCR扩增反应

2、中扩增反应中每一每一个循环产物个循环产物荧光荧光信号的信号的实实时时检测检测从而实现对从而实现对起始模起始模板板定量及定性的分析定量及定性的分析 扩增曲线、阈值、扩增曲线、阈值、CTCT值值C CycleycleNormalised reporter Normalised reporter Fluorescence Fluorescence （Rn)Rn)BaselineBaselineExponentialExponential phase phaseplateau phaseplateau phaseThreshold lineThreshold lineCt ValueCt ValueL

3、iner phaseLiner phase（1 1）扩增曲线）扩增曲线(Amplification)(Amplification)随着随着PCRPCR反应的反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强进行，每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。纵坐标：纵坐标：RnRn（荧光值）（荧光值） 横坐标：横坐标：cycle numbercycle number（循环数）（循环数）线线性图性图对数图对数图荧光信号变化与荧光信号变化与PCRPCR循环数的变化循环数的变化直观！直观！荧光信号

4、变化的对数与荧光信号变化的对数与PCRPCR循环数的变化循环数的变化确定阈值线！确定阈值线！（2 2）阈值）阈值(Threshold)(Threshold) 在荧光扩增曲线上人为设定的一个值在荧光扩增曲线上人为设定的一个值。它可以设定在荧它可以设定在荧光信号光信号指数期指数期任意位置上，一般荧光域值设置是基线荧光信任意位置上，一般荧光域值设置是基线荧光信号号( (一般是一般是PCR PCR 315个循环个循环荧光信号）的标准偏差的荧光信号）的标准偏差的10倍。倍。Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phaseThreshold平台期平台期1

5、 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）1 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值（3 3）CtCt值值(Cycle threshold)(Cycle threshold) PCRPCR过程中，每个反应管内扩增产物的荧光信号达到设过程中，每个反应管内扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。定的阈值时，所经过的扩增循环数。相同模板进行多次扩相同模板进行多次扩增，终点处产物量不恒定，但增，终点处产物量不恒定，但CtCt值极具重现性值极具重现性。

6、理想的理想的PCR反应反应: :XnX0 2nX X0 0：起始模板数量起始模板数量n n：扩增循环数扩增循环数Xn n：第第n n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量非理想的非理想的PCR反应：反应：XnX0 （1Ex）n Xn n：第第n n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X X0 0：起始模板数量起始模板数量n n：扩增循环数扩增循环数 Ex Ex：PCRPCR扩增效率扩增效率 在扩增产物达到荧光阈值时所经历的循环数为在扩增产物达到荧光阈值时所经历的循环数为Ct个循环，此个循环，此时：时： XCt X0 （1Ex）Ct M XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值

7、设：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，设为定以后，它是一个常数，设为M上式两边同取对数得：上式两边同取对数得：LogMLog X0 （1Ex）Ct 整理得：整理得：LogX0 Ct Log（1Ex）+ Log MCycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration0 模板模板DNA量越多，荧光达量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即到阈值的循环数越少，即Ct值越小。值越小。0 Log模板起始浓度与模板起始浓度与Ct值值呈线性关系。呈线性关系。 另一种思路另一种思路 由于由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与反

8、应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成产物的量成正比，所以可以用荧光强度来代替正比，所以可以用荧光强度来代替PCR产物的量，同时考虑产物的量，同时考虑荧光本底值，则：荧光本底值，则： Rn= RB+ X0(1+ Ex) RsRn：第：第n个循环时的总信号个循环时的总信号RB：本底：本底RS：单位信号强度：单位信号强度X0：起始：起始DNA数目数目Ex：PCR扩增效率扩增效率 类似的，当循环数类似的，当循环数n n等于等于C Ct t值时，可推出：值时，可推出： Ct lg (1+Ex) = -lg X0 + lg (RT-RB) lg Rs 变形得变形得: 此时，此时，PCRPCR反应处

9、于指数期阶段，所有样品的反应效率反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率E Ex x稳定且近似相等；稳定且近似相等；lg(Rlg(RT T -R -RB B) )、RsRs也都相同，只有也都相同，只有C Ct t值值和和-lgX-lgX0 0为变量，且这两个变量之间成线性关系。也就是说，为变量，且这两个变量之间成线性关系。也就是说，根据样品扩增达到域值的循环数即根据样品扩增达到域值的循环数即CtCt值就可计算出样品中值就可计算出样品中所含的模板量。所含的模板量。线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认标准曲线斜率标准曲线斜率: -3 到到 -3.5相关系数（相关系数（R2）：大于）：大于0.

10、98PCR扩增效率（扩增效率（Ex）: 0.9到到1.2荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210扩增效率扩增效率扩增效率理论值为扩增效率理论值为1，即每增加一个循环，即每增加一个循环PCR产物加倍。产物加倍。那么，那么，根据扩增效率根据扩增效率ExEx与标准曲线斜率的关系与标准曲线斜率的关系，优化的标准，优化的标准曲线斜率应该为曲线斜率应该为-3.32。非特异性荧光标记非特异性荧光标记 DNA结合染料结合染料 （SYBR Green）特异性荧光标记特异性荧光标记 探针探针（Taqman、Beaco

11、n、FRET、Amplifluor）引物引物（、LUX primer）（1 1）SYBR GreenSYBR Green法法 融解曲线（融解曲线（melt curve)温温度度荧光强荧光强度度Tm-dIdTTm-dIdTTm融解曲线分析，单一峰融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析，出现杂融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准性荧光，因此定量不准确确SYBR Green法优缺点法优缺点（2）TaqMan探针法探针法TaqMan作用机理作用机理在退火过程中，探针与靶序列结合在退火过程中，探针与靶序列结合探针被探针被T

12、aq酶的酶的5- 3 外切酶活性剪切成片外切酶活性剪切成片断断游离报告基团发出荧光游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离在延伸过程中，探针部分与靶序列分离TaqMan法优缺点法优缺点% 高度特异性高度特异性% 重复性好重复性好% 灵敏度高灵敏度高% 可进行多重可进行多重PCR定量定量优优 点点% 只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标% 委托公司标记，价格较高委托公司标记，价格较高% 背景高，不易找到本底低的探针背景高，不易找到本底低的探针% 不能进行融解曲线分析不能进行融解曲线分析缺缺 点点（3）分子信标）分子信标 Beacon法法发夹型杂交探针发夹型杂交探针 分子信标是呈

13、发夹结构的茎分子信标是呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针环双标记寡核苷酸探针 环与目标序列互补，环与目标序列互补，茎由互茎由互补配对序列组成补配对序列组成 发夹结构的两端分别连接荧发夹结构的两端分别连接荧光基团和淬灭基团光基团和淬灭基团 利用分子构象的改变使得荧利用分子构象的改变使得荧光基团和淬灭基团分开光基团和淬灭基团分开 常用的荧光基团有常用的荧光基团有FAM、Texas Red环茎荧光素 淬灭剂（4）FRET法法Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer二、荧光定量二、荧光定量PCR的定量方法的定量方

14、法绝对定量和相对定量绝对定量和相对定量绝对定量绝对定量0 Sample25拷贝数计算拷贝数计算对标准品进行梯度浓度稀释对标准品进行梯度浓度稀释荧光定量荧光定量PCR反应反应建立标准品建立标准品未知样品未知样品CtCt代入标准曲线确定拷贝数代入标准曲线确定拷贝数质粒提取质粒提取ODOD值测定值测定计算待测样本浓度计算待测样本浓度/ /样本分子量样本分子量/ /待测样本拷贝数待测样本拷贝数标准品进行标准品进行5-65-6个个梯度稀释梯度稀释标准品稀释倍数标准品稀释倍数为为1010绝对定量实验构建流程绝对定量实验构建流程绝对定量分析要素绝对定量分析要素引物设计引物设计DNAPCR扩增扩增扩增产物扩增

15、产物纯化纯化与克隆载与克隆载体连接体连接转化转化培养培养重组克隆重组克隆筛选筛选感受态感受态质粒提取质粒提取PCR或或酶切鉴定酶切鉴定计算拷贝计算拷贝倍比稀释倍比稀释备用备用质粒标准品的制备质粒标准品的制备质粒质粒目的基因目的基因目的基因克隆目的基因克隆质粒提取，质粒提取，OD值定量值定量拷贝数计算拷贝数计算 9696孔板设置举例孔板设置举例SampleSamplecopies/mlcopies/mlCt1Ct1Ct2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD标准品510330.5830.6430.610.03标准品510428.1828.6428.410.16标准品510525.2525

16、.1425.190.04标准品510622.1122.4622.280.12标准品510718.6318.9218.770.10未知样品? ?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone E = 10-1/斜率斜率 1 = 10-1/-3.29 1 = 2.011 = 1.01 利用利用Mean Ct 作图可得到标准曲线作图可得到标准曲线y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978未知样品拷贝数计算：未知样品拷贝数计算：20.5 = -3.29 X + 40.33Quantity Sample = 10 6.03 = 1071519 copies X =20.5

17、-40.33-3.29= 6.03因为因为这里算出的这里算出的X其实是其实是logX0, X0起始起始DNA模板数模板数相对定量法相对定量法必要性必要性相对定量分析要素相对定量分析要素 特点特点选择内参基选择内参基因因内参基因内参基因beta-actin、GAPDH、18S rRNA等看家基等看家基因因(house-keeping gene)在各组织和细胞中在各组织和细胞中的表达量或在基因的表达量或在基因组中的拷贝数相对组中的拷贝数相对恒定，受环境因素恒定，受环境因素影响较小影响较小- - 文献检索文献检索- - 实验筛选实验筛选对样本初始浓度差异进行均一化校正。对样本初始浓度差异进行均一化校

18、正。校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。的准确性。.2Ct法法双标准曲线法双标准曲线法 相对定量方法相对定量方法相对定量实验构建流程相对定量实验构建流程双标准曲线法双标准曲线法公式：公式： 待测样品目的基因浓度待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度待测样品内参基因浓度 F=F= 对照样品目的基因浓度对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度对照样品内参基因浓度优点：优点：分析简单，实验优化相对简单分析简单，实验优化相对简单缺点：缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线适用

19、条件：适用条件：内参基因和目标基因扩增效率不同内参基因和目标基因扩增效率不同扩增效率较低扩增效率较低检测样品检测样品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量结果定量结果定量结果定量结果校正值校正值相对值相对值对照样品对照样品6391.56391.5343.4343.40.05370.0537待测样品待测样品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待测样品待测样品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874数据处理举例数据处理举例假设检测假设检测A A基因在某因子干预下的表达，得到一组

20、数据结果基因在某因子干预下的表达，得到一组数据结果如下：如下：2 2CtCt法法优点：优点：无需作标准曲线无需作标准曲线缺点：缺点：实验条件优化较为复杂实验条件优化较为复杂适用条件：适用条件：内参基因和目标基因扩增效率接近，均接内参基因和目标基因扩增效率接近，均接近近100%标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致公式：公式：F =2 待测样品目的基因平均Ct值待测样品内参基因平均Ct值对照样品目的基因平均Ct值对照样品内参基因平均Ct值-目标基因和内标基因扩增效率的快速检目标基因和内标基因扩增效率的快速检测测验证试验验证试验目的基因和内参基因扩增效率一

21、致性检测目的基因和内参基因扩增效率一致性检测检测目标基因与内参基因在不同稀释浓度下的检测目标基因与内参基因在不同稀释浓度下的Ct，以稀，以稀释倍数与释倍数与Ct作图，当直线的斜率近似于作图，当直线的斜率近似于0（绝对值应小（绝对值应小于于0.1）时，说明目标基因与内）时，说明目标基因与内参参基因扩增效率一致。基因扩增效率一致。2 2CtCt法公式推导法公式推导 或或 修正方法：修正方法：如果知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等如果知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于于2，那么，那么2Ct可以修正为用实际扩增效率值代替可以修正为用实际扩增效率值代替2，即，即

22、ECt。例如扩增效率为例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为，那么计算公式可修正为1.95CtSample Jun(Mean Ct)GAPDH(Mean Ct)CtCtCt2 2CtCt1181710121617.4-1.4-2.4数据处理举例数据处理举例以以1 1号样本为对照样品，号样本为对照样品，2 2号样本为待测样品号样本为待测样品第一步：应用内参基因对对照样本和待测样本进行校正第一步：应用内参基因对对照样本和待测样本进行校正 Ct(Ct(对照样本对照样本) )Jun(Mean Ct)1GAPDH(Mean Ct)1181817171 1 Ct(Ct(待测样本待测样本) )Jun(

23、Mean Ct)2GAPDH(Mean Ct)2161617.4=17.4=1.41.4第二步：对照样本和待测样本的第二步：对照样本和待测样本的CtCt进行归一化进行归一化 Ct=Ct=Ct(Ct(待测样本待测样本) )Ct(Ct(对照样本对照样本) )1.41.41 12.42.4第三步：基因表达差异计算第三步：基因表达差异计算 2 2CtCt2 2（2.42.4） = 5.3 = 5.3 所以所以2 2号样本的号样本的JunJun基因表达水平是基因表达水平是1 1号样本的号样本的5.35.3倍倍Thank you!实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理和定量方法原理和定量方法一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR的原理的原理 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧荧光基团光基团，利用荧光信号累积，利用荧光信号累积实现了实现了实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，进程，对对起始模板起始模板进行定量分析的进行定量分析的方法。方法。三个关键词：三个关键词：实时，定量，荧光实时，定量，荧光 类似的，当循环数类似的，当循环