PCR技术及肿瘤三项介绍

1、PCRPCR技术及肿瘤三项应用PCR PCR的基本原理 变性,复性,半保留复制 PCR三步曲 变性 9097 退火 4555 延伸 72左右聚合酶链式反应： 是一种放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。 循环次数循环次数 DNA的链数的链数 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿亿 PCR循环次数与循环次数与DNA产量关系产量关系PCR特点：高效扩增、忠实复制特点：高效扩增、忠实复制实时荧光定量PCR 是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法

2、。 实现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强，能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 。荧光定量PCR的临床应用年龄年龄老年，儿童，老年，儿童，新生儿新生儿 性别性别体重体重/ /身高身高 合并症合并症病程病程器官功能器官功能肝脏肝脏, , 肾脏肾脏, , 心脏心脏基因型基因型环境因素环境因素食物食物 / /吸烟吸烟 / / 合并用药合并用药药物反应药物反应7预警预警遗传相关疾病遗传相关疾病疾病相关疾病相关遗传缺损遗传缺损药物基因组学药物基因组学关联分析关联分析药物相关药物相关遗传缺损遗传缺损预防预防个体化治疗个体化治疗HGPHGP启动了个体化医学启

3、动了个体化医学/ /基因组医学基因组医学 治疗方法开发治疗方法开发基因治疗基因治疗 药物治疗药物治疗n人基因数：人基因数：22,00022,000n潜在药靶：潜在药靶：22,00022,000n现有药靶：现有药靶：5005008个体化药物治疗的目的个体化药物治疗的目的 避免药物不良反应避免药物不良反应 最大化药物效应最大化药物效应 选择有效个体选择有效个体p EGFR基因突变检测基因突变检测p KRAS基因突变检测基因突变检测p BRAF基因突变检测基因突变检测p 二氢嘧啶脱氧酶（二氢嘧啶脱氧酶（DPD）基因突变检测）基因突变检测p UGT1A1基因多态性检测基因多态性检测PCR技术在肿瘤个性

4、化治疗中的应用 肺癌居于我国恶性肿瘤死亡率之首，每年新增60万患者，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占85%。 EGFR 表皮生长因子受体; 是上皮生长因子细胞增值和信号传导的受体；与肿瘤细胞的增殖，血管生成，肿瘤侵袭，转移及细胞凋亡抑制有关。 KRAS 鼠类肉瘤病毒癌基因；是细胞信号内传导途径中的一种信号传导蛋白；像是体内的一个开关，正常时可以抑制肿瘤细胞生长，一旦突变，就会刺激细胞生长，打乱规律，从而导致肿瘤的发生。 BRAF 是一种癌基因，是EGFR通路中的重要转导因子，参与调控细胞生长，分化和凋亡等多种生理过程。 肿瘤三项肿瘤三项12TKTK细胞存活细胞存活(抗细胞凋亡抗细胞凋亡)PI3

5、-KSTAT3AKTPTENMEK基因转录MAPK细胞增殖细胞增殖/分化分化化疗化疗/放疗抵抗放疗抵抗血管增生血管增生肿瘤细胞迁移扩散肿瘤细胞迁移扩散pYpYRAS RAFSOSGRB2pYG1SMG2l非小细胞肺癌非小细胞肺癌(NSCLC) (NSCLC) 组织中组织中EGFREGFR高表达；高表达；lEGFREGFR对肿瘤的增殖、分化、迁对肿瘤的增殖、分化、迁移等起重要作用移等起重要作用l抑制抑制EGFREGFR活性可阻断下游的信活性可阻断下游的信号传导，抑制肿瘤细胞生长、号传导，抑制肿瘤细胞生长、转移和血管增生，促进肿瘤细转移和血管增生，促进肿瘤细胞凋亡胞凋亡表皮生长因子受体（表皮生长因

6、子受体（EGFREGFR） 用于检测肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤患者肿瘤组织用于检测肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤患者肿瘤组织EGFR（表皮生长因子受体）基因的突（表皮生长因子受体）基因的突变情况。变情况。 EGFR突变检测可协助医生选择易瑞沙（突变检测可协助医生选择易瑞沙（Iressa，Gefitinib，吉非替尼，吉非替尼)、特罗凯、特罗凯（Tarceva，它赛瓦；，它赛瓦；Erlotinib，厄洛替尼）等靶向药物的有效人群。，厄洛替尼）等靶向药物的有效人群。EGFR突变的患者突变的患者建议使用该类药物治疗，无突变者不建议使用该类靶向药物。建议使用该类药物治疗，无突变者不建议使用该类靶向药物。EGF

7、REGFR基因突变检测是NSCLCNSCLC靶向用药的必检项目 K-ras基因是编码一个GTP结合蛋白的癌基因，其表达产物是EGFR信号传导通路上的重要蛋白。 K-ras基因突变一般会使结直肠癌和肺癌患者络氨酸激酶抑制剂产生耐药。判断肿瘤的发生发展、预后以及了解肿瘤的治疗效果：判断肿瘤的发生发展、预后以及了解肿瘤的治疗效果：1.1. 正常人血中检出正常人血中检出KrasKras基因异常，提示存在肿瘤易感性；基因异常，提示存在肿瘤易感性；2.2. 良性肿瘤患者检出良性肿瘤患者检出KrasKras基因突变基因突变, ,提示有恶变的可能；提示有恶变的可能；3.3. KrasKras基因突变阳性，即使

8、病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高；基因突变阳性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高；4.4. 美国国立癌症综合网络美国国立癌症综合网络(NCCN)(NCCN)肿瘤临床指南及其中译版均明确指出：只有肿瘤临床指南及其中译版均明确指出：只有K-K-rasras野野生型患者才建议接受靶向药物的治疗，突变型患者不建议进行分子靶向治疗。生型患者才建议接受靶向药物的治疗，突变型患者不建议进行分子靶向治疗。5.5. 检测检测KrasKras基因突变可筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。基因突变可筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期

9、。17增殖增殖野生野生KRAS EGFR西妥昔单抗西妥昔单抗细胞内细胞内细胞外细胞外细胞膜细胞膜野生型野生型K-rasK-ras野生型的野生型的EGFREGFR通路通路K-rasK-ras突变型的突变型的EGFREGFR通路通路CTGGTGCCG增殖增殖突变突变KRASEGFR西妥昔单抗西妥昔单抗细胞内细胞内细胞外细胞外细胞膜细胞膜突变型突变型无效应！无效应！KRAS突变为活化突变为活化突变，使增殖不受突变，使增殖不受上游信号控制上游信号控制n12、13(96%)和和61密码子密码子 n12号号35GA(甘甘天门冬）为主天门冬）为主CTGATGCCGnKrasKras基因是基因是RASRAS超

10、家族中的原癌基因，超家族中的原癌基因，其编码蛋白的激活其编码蛋白的激活/ /失活受控于上游失活受控于上游EGFREGFR信号。信号。l单克隆抗体阻断单克隆抗体阻断EGFREGFR和和KrasKras蛋白蛋白等下游信号传导通路，抑制和逆等下游信号传导通路，抑制和逆转肿瘤的发生和发展。转肿瘤的发生和发展。n突变型突变型KrasKras蛋白功能异常，无需蛋白功能异常，无需EGFREGFR活化信号刺激仍处于激活状态，活化信号刺激仍处于激活状态，且不可控而始终处于激活状态，导且不可控而始终处于激活状态，导致肿瘤的持续增殖。致肿瘤的持续增殖。l对抗对抗EGFREGFR药物治疗无效。药物治疗无效。黑色素瘤概

11、况 恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为35。2010年全球黑色素瘤新发病例199 627例，死亡例数为46372例1。 虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，每年新发病例约2万例1。1CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版)，临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期BRAF基因与黑色素瘤 检测我国468例原发黑色素瘤标本，BRAF突变率为25,9其中BRAFV600E是最常见的突变位点(87)，这为中国患者使用BRAFV600E抑制剂(Vemurafenib)提供了理论基础1。 B-

12、raf基因V600E突变导致抗EGFR抗体或EGFR酪氨酸激酶抑制剂类肿瘤靶向药物的耐药。 部分没有 K-ras 基因突变的患者也会对 EGFR靶向药物产生耐药性，研究证明这主要是由于K-ras 下游的 B-raf 基因 V600E 突变造成的1CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版) 临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期 B-raf B-raf 基因突变在多种恶性肿瘤细胞中都有报道，除了结基因突变在多种恶性肿瘤细胞中都有报道，除了结直肠癌外，直肠癌外，B-raf B-raf 在恶性黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌、卵巢癌等在恶性黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌、卵巢癌等均存在不同

13、比例的突变。检测均存在不同比例的突变。检测 B-raf B-raf 基因突变可用于指导基因突变可用于指导EGFR-EGFR-TKI TKI 的靶向用药的靶向用药谢 谢荧光定量PCR的临床应用 肺癌居于我国恶性肿瘤死亡率之首，每年新增60万患者，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占85%。 EGFR 表皮生长因子受体; 是上皮生长因子细胞增值和信号传导的受体；与肿瘤细胞的增殖，血管生成，肿瘤侵袭，转移及细胞凋亡抑制有关。 KRAS 鼠类肉瘤病毒癌基因；是细胞信号内传导途径中的一种信号传导蛋白；像是体内的一个开关，正常时可以抑制肿瘤细胞生长，一旦突变，就会刺激细胞生长，打乱规律，从而导致肿瘤的发生。

14、BRAF 是一种癌基因，是EGFR通路中的重要转导因子，参与调控细胞生长，分化和凋亡等多种生理过程。 肿瘤三项肿瘤三项 K-ras基因是编码一个GTP结合蛋白的癌基因，其表达产物是EGFR信号传导通路上的重要蛋白。 K-ras基因突变一般会使结直肠癌和肺癌患者络氨酸激酶抑制剂产生耐药。黑色素瘤概况 恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为35。2010年全球黑色素瘤新发病例199 627例，死亡例数为46372例1。 虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，每年新发病例约2万例1。1CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版)，临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期BRAF基因与黑色素瘤 检测我国468例原发黑色素瘤标本，BRAF突变率为25,9其中BRAFV600E是最常见的突变位点