蛋白质浓度测定方法 ppt课件

1、蛋白质浓度测定方法蛋白质浓度测定方法四种古老的经典方法：四种古老的经典方法：定氮法定氮法双缩尿法双缩尿法Biuret法法Folin酚试剂法酚试剂法Lowry法法紫外吸收法紫外吸收法新的测定法：新的测定法：考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法Bradford法法更新的测定方法：更新的测定方法：BCA法法分光光度计的运用分光光度计的运用 原理原理光线的本质是电磁波的一种，光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波的彩色光称为可见光，波长范围在长范围在400750nm：小：小于于400nm的光线称为紫外的光线称为紫外光；大于光；大于750nm的光线称的光线称为红

2、外光。为红外光。当光线经过透明溶液介质时，当光线经过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质收和透过可用于某些物质的定性定量分析。的定性定量分析。 根据Lambert-Beer朗伯比尔定律，一束单色光经过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。详细丈量时，补充知识型可见分光光度计紫外分光光度计紫外分光光度计微量凯氏微

3、量凯氏Kjeldahl定氮法定氮法原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨消化，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。以甘氨酸为例，其反响式如下：NH2CH2COOH + 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) 2NH3 + H2SO4 =(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反响1、(2)在凯氏瓶内完成，反响3在凯氏蒸馏安装中进展。为了加速消化，可以参与CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。

4、搜集氨可用硼酸溶液，滴定那么用强酸。器材1. 100ml凯氏烧瓶2. 改良型凯氏定氮仪3. 50ml容量瓶4. 分析天平电子天平5. 烘箱 6. 电炉 7. 酒精灯8. 小玻璃珠 9. 滴定管10. 洗瓶11. 锥形瓶12.铁架台 试剂 1. 消化液：30% H2O2 浓H2SO4 H2O=3 2 1 2. 30% NaOH溶液 3. 2% H3BO3溶液 4. 混合催化剂粉末K2SO4- CuSO4混合物K2SO4与CuSO4以3 1比例充分研细混匀。 5. 0.01mol/L规范盐酸溶液 6. 混合指示剂田氏指氏剂取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200m

5、l，混合，贮于棕色瓶中备用。该指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄pH5.25.6且很灵敏。 7. 蒸馏水 假设测定的样品含氮部分只是蛋白质，那么样品中蛋白质含量%=总氮量6.25 假设样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，那么需向样品中参与三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及参与三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。 蛋白氮 = 总氮 - 非蛋白氮 蛋白质含量g %= 蛋白氮 6.25双缩脲法N 端端C 端端 双缩脲双缩脲 加热NH322H1800双缩脲22222双缩脲反响:碱性环境 H2O O=C C=O HN NH

6、 R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物原 理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反响而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反响。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+构成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。在一定的实验条件下，未知样品溶液与规范蛋白质溶液同时反响，并于540560nm测定，即可以经过规范蛋白质的规范曲线求出未知样品的蛋白质浓度。试剂试剂一一 试剂试剂1规范酪蛋白溶液规范酪蛋白溶液5mg/ml用用0.05mol/L NaOH溶液配制：溶液配制：5g酪蛋白加酪蛋白加0.0

7、5mol/L NaOH溶液至溶液至1 000ml。2双缩脲试剂双缩脲试剂溶解溶解1.5g硫酸铜硫酸铜CuSO4 5H2O和和6.0 g酒石酒石酸钾钠酸钾钠NaKC4H4O6 4H2O于于500ml蒸馏水中。在搅蒸馏水中。在搅拌下参与拌下参与10% NaOH溶液溶液300ml，用蒸馏水稀释到，用蒸馏水稀释到1升，升，储存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保管。储存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保管。3未知蛋白质溶液未知蛋白质溶液球蛋白溶液。球蛋白溶液。Folin酚试剂法Lowry法蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，构成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸复原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利

8、用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作规范曲线并测定样品中蛋白质的浓度。该化合物在750nm有最大吸收峰。试剂：一：1，4%碳酸钠；2，0.2N氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。1和2等体积混合，3和4等体积混合，然后将两液以50：1混合(甲)。当天运用。二：1NFolin-酚试剂(乙)。 方法：规范曲线；试管中加0、0.2、0.40、0.60、1.00毫升酪蛋白溶液500微克/毫升，加水补足1毫升，平行做两份。按序各加5毫升试剂甲，摇匀，室温置放10分钟，再依次参与1N0.5毫升Folin-酚试剂乙，摇匀，30摄氏度保温30分钟。然后在分光光度机上比色测定A750。考马斯亮蓝染色法测

9、定蛋白质浓度考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以经过测定染料在595nm处光吸收的添加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高比Lowry法灵敏4倍。 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+总蛋白定量分析总蛋白定量分析BCABicinchoninic acid，二辛可宁酸、二

10、羧基二喹啉二辛可宁酸、二羧基二喹啉准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20g/ml快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济适用：除试管外，测定可在微孔板中进展，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝 根本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+复原为Cu+， Cu+与BCA试剂构成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与规范曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光

11、的性质。吸收顶峰在280nm处，其吸光度即光密度值与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进展蛋白质含量的测定。 紫外吸收法测蛋白质含量紫外吸收法测蛋白质含量 三、操作步骤1.取15支试管，按下表编号、加试剂管号0123456样品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.64.86.02mg/mL牛血清白蛋白体积(mL)00.30.61.21.82.43.0待测液体积(mL)3.0*蒸馏水(mL)3.02.72.41.81.20.600OD5402.各管混匀后，参与双缩脲试剂3.0mL,37oC反响30min。3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。四、结果处置1.绘制规范曲线以牛血洁白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制规范曲线。2.样品的计算根据样品的OD540从规范曲线上查得样品的蛋白质含量mg，再根据样品的体积计算出样品的浓度。五、本卷须知1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽能够一致。2.*样品