植物生理生化指标测定

1、小黑豆相关生理指标测定1.表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积鲜重：取处理好的植株，擦十根和叶表面水分，测量整株植物的重量，每个测 6 个重复。株高：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度，记录，每个测 6 个重复。主根长：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测 6 个重复。叶面积：取处理好的植株，选择第二节段的叶片，测量叶面积，叶面积测量方法 是测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和 宽的乘积即为叶表面积。每个测 6个重复。2.总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA ）和 H2O2 含量测定样品处理：取 0.5g 样品（叶片要去

2、除叶脉、根要先用活水活洗十净），速在 液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl （ pH7.4） 抽提，将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中，于 4C, 12000rpm 离心 15min,取上活， 保存在-20 C下，上活液可用于总蛋白、丙二醛（MDA ）、可溶性糖和 H2O2 含 量测定。总蛋白测定 （Bradford 法） ： 样品反应体系 （800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品） ，空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford ）。测定后带入标准曲线 Y=32.549X-0.224（Y代表蛋白含量，X代表

3、 OD595）,计算得出蛋白含量。可溶性糖测定：样品反应体系（1ml 蕙酮+180ul ddH2O+20ul 样品提取液）； 空白对照（1ml 蕙酮+180ul ddH2O）,测定 OD625 后带入标准曲线： Y=0.0345X+0.0204（Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量（ug）蕙酮配方：称取 100mg 蕙酮溶于 100ml 稀硫酸（76ml 浓硫酸+30mlH2O）. 注意：浓硫酸加入水中时，一点一点递加，小心溅出受伤。丙二醛（MDA）测定：在酸性和高温条件下，丙二醛可与硫代巴比妥（TBA）反应生成红棕色的 3,5,5-三甲基恶哇 2,4-二酮，在 532nm 处有最大吸收

4、波长，但 该反应受可溶性糖的极大十扰，糖与 TBA的反应产物在 532nm 处也有吸收，但 其最大吸收波长在 450nm 处。采用双组分分光光度法，可计算出 MDA 含量。 MDA 的计算公式为：MDA （umol/L）=6.45OD532-0.56OD450.反应体系为：400ul 0.6%TBA+350ulH2O+50ul 样品，80 C 水浴 10min 后，测 OD532 和OD450。对照用 Tris-HCl.0.6%TBA 配方：称取硫代巴比妥 0.6g,溶于少量 1M NaOH 中，待其完全 溶解后用 10%TCA （称取 10gTCA 三氯乙酸，溶于 100ml 蒸僻水中，待其

5、溶解 即可）定容至 100ml。H2O2 测定 （二甲酚橙法） ： 样品反应体系 （82ul 溶液 A+820ul 溶液 B（A:B=1:10 ）+150ul 样品提取液），30C 水浴 30min,测 OD560。标准曲线 为:Y=0.01734X-0.0555（Y 代表 OD560, X 代表 H2O2 含量）溶液A (200ml): FeSO4.7H2O 0.1835g (NH4)2SO4 0.0872g； H2SO4(浓硫酸18M)4.58ml ,加水定容。溶液 B (200ml):二甲酚橙 0.0234g；山梨醇 6g,加水定容到 200ml3.可溶性蛋白、SOD、POD 和 CAT

6、 活性测定样品处理：取 0.5g 样品，速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.0)(内含有 20%甘油、1mmol/L ASA (抗坏血 酸)、1mmol/L DTT (二硫苏糖醇)、1mmol/L EDTA、1mmol/L GSH (还原型谷 胱甘肽)、5mmol/L MgCl2)抽提，将抽提液转移到 2ml 的 EP管中，于 4C, 12000rpm 离心 15min,取上活，保存在-20C 下，上活液可用于可溶性蛋白、SOD、 POD 和 CAT 含量测定。1mmol/L 的 ASA 配制：先配制 10mmol/L 的母液一称取

7、176.13mg 的 ASA, 溶于100ml 的 Tris-HCl (pH7.0)中即可，然后稀释 10 倍即可。1mmol/L的 DTT配制： 先配制 10mmol/L的母液一称取 154.25mg的 DDT 溶于 100ml 的 Tris-HCl (pH7.0)中即可，然后稀释 10 倍即可。1mmol/L 的 EDTA配制：用 30mmol/L的 EDTA稀释 30 倍即可。5mmol/L 的 MgCl2 配制：称取 MgCl2.6H2O 的 101.5mg 溶于 100ml 的 Tris-HCl(pH7.0),即可。样品提取液的配制(200ml):取 10mmol/L 的 ASA 母

8、液 20ml, 10mmol/L 的母液DTT20ml,取 30mmol/L 的 EDTA 母液 7ml,称取 203mg 的 MgCl2.6H2O , 最后再量取20ml 的甘油，将最终体积定容到 200ml,即可。可溶性蛋 白测定(Bradford 法)：样品反 应体系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul样 品 ) ， 空 白 对 照 为 (800ul H2O+200ul Bradford) 。 测 定 后 带 入 标 准曲 线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X 代表 OD595),计算得出蛋白含量。SOD 测定：SOD 活性的测定是根据照光时，体系中

9、产生氧自由基使硝基四 口坐蓝还原成蓝色甲(在 560nm 处有一吸收峰),而超氧化物歧化酶作为氧自由基的活除剂可抑制此反应。？一个酶活单位定义为将硝基四哇蓝的还原抑制到对照 一半(50 %)时所需的酶量。14.5mmol/L 的 dl-甲硫氨酸(分子量 149.21)(现用现配)：称取甲硫氨酸 216.4mg,加少量 Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用 Tris-HCl(pH7.0)定容到 100ml,即 可。30mmol/L 的 EDTA (292.25)(现用现配)：称取 EDTA 药品 876.75mg,加 少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用 Tris-HCl(pH7.0

10、)定容到 100ml,即可。2.25mmol/L 的 NBT (硝基四哇蓝)(817.6)(现用现配)：称取 NBT 药品 183.96mg,加少量 Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用 Tris-HCl(pH7.0)定容到 100ml,即 可。60umol/L的核黄素(376.36)(现用现配)： 先称取 225.81mg的核黄素， 加少 量 50mMTris-HCl(pH7.4)溶解后，用 50mM Tris-HCl(pH7.4)定容到 10ml,配制成 60mmol/L的母液，然后取 100ul 至 U 100ml 的 Tris-HCl(pH7.4)中，即可配制成 60umol/L

11、的核黄素。测酶活的反应介质：测定前在 54ml 的 14.5mmol/L 的 dl-甲硫氨酸中分别加 入EDTA、NBT 和核黄素各 2ml,此为反应混合液。酶活测定：在盛有 1.0ml 反应液的试管中，加入适量的酶液（50ul）（以抑 制达50%作用酶浓度为最佳） 。 混匀后放在透明的试管架上， 于光照培养箱中准 确照光 10min后，迅速测定 560nm处的光密度。以不加酶液照光液的为对照，计算反应被抑制的白分比。按下式计算超氧化物歧化酶的活性 AX N酶活力 =-AOX W TX VX 50%式中：酶活力单位为每 min每 g鲜重酶活单位数；AO 为对照试管溶液在 560nm 处的吸光度

12、值； A为对照试管溶液在 560nm 处的吸光值与加入酶液的反应液在 560nmft 的吸光值的差；N为酶液总体积；W为提取酶液的样品鲜重 g；T 为照光时间 （10min） ；V为加入酶液的体积（ml）；POD 测定（愈创木酚法）：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分 光光度计测量生成物的含量。反应混合液配制： 在 50ml 的 50mmol/L 的 Tris-HCl （pH7.0） 缓冲液中加入 28ul 的愈创木酚，与磁力搅拌器上加热搅拌直至愈创木酚溶解，再加入 19ul 的 30% 的 H2O2,混合均匀，4

13、C 保存。酶活测定：取反应混合液 1.0ml,加入 0.1ml酶提取液，2min 前后，于 470nm 处测OD 值，每隔 1min 读数一次，以每分钟 OD值的变化表示 SW 舌大小。（测量 时再加入酶液）CAT 测定（H2O2 法）反应缓冲液：20mM 的 H2O2,使用前在 25C 水浴中加热 30min。酶活测定：取反应液 1.4ml，加入 100ul 酶液，每加完一管立即计时，并迅 速在波长 240nm 下测定 30S、1min30S、2min30S 时的吸光度，以 Tris-HCl 的 作为空白。以 1min 内 A240 减少 0.1 的酶量为 1个酶活单位。代入酶活力公式，以OD*V/0.1*v*tFW 表示 CAT 活性，所有测定均重复三次。 OD 代表空白的吸光度-样品管的吸光度；V 代表酶提取液的总体积，v代表测量是加入的样 品体积；t 代表反应时间 min, FW 代表样品鲜重。0.1mol/LH2O2 配方：称取 1.1333g 的 30%的 H2O2,加入 100ml 的 50mmol/L 的Tris-HCl（pH7.4），即可。也可以用 0.01%的 H2O2