毕赤酵母常用培养基与载体

1、毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体:典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶-1 （AOX1）基因的启动子和转录终止子（5AOX1 和 3AOX1 ），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基 因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4 ）选择标记及 3AOX1 区。当整合型载体转化受体时，它的 5AOX1 和 3AOX1 能与染色体上的同源基 因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在 5AOX1 启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有 引导分泌的信号序列。而由 89个氨基酸组成的酿洒酵母的分泌信号 一 a交配

2、因 子（factor）引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。 分泌表达载体主要有:pPIC9 , pPIC9K ,pHIL-S1 , pPICZaA, pYAM75P等。胞内表达载体主要 有：pHIL-D2 ,pA0815 ,pPIC3K ,pPICZ , pHWO10 , pGAPZ , pGAPZa（Invitrogen） , pPIC3.5K 等。工程菌株 Y11430 ,MG1003 , GS115（AOX1 ）, KM71 , SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有 GS115 和 KM71 两种， 都具有 HIS4 营养缺陷标记。其中，GS115 茵株具有 AOX1 基因，是

3、 Mut+,即 甲醇利用正常型；而 KM71 菌株的 AOX1 位点彼 ARG4 基因插入，表型为 Muts , 即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。 多拷贝表达菌株的 获得方式： 与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以 有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源 基因的申联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载

4、体中，而后再通过 交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白， 分泌型表达的蛋白有利 于纯化，可用硫酸铉沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进 一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。二.毕赤酵母表达的培养基配制和用途2.1LB (Luria Bertani )培养基：Trypton l %Yeast Extract 0.5%NaCl lPH 7.0制作平板时加入 2 %琼脂粉。121 C 高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养 pPICZ a A 原核宿主菌 TOP10F时可加入

5、Zeocin 25ug / ml 。2.2LLB (Low Salt LB )培养基：Trypton l %Yeast Extract 0.5PH 7.0制作平板时加入 2 %琼脂粉。121 C 高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养 pPICZ a A 原核宿主菌 TOP10F时，加入 Zeocin 25ug / ml ，可以 4C条件下保存 12 周.2.3YPD （乂称 YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium , （Yeast Extract Peptone Dextrose Medium ,酵母浸出粉/胰蛋白月东/右旋葡萄糖培养基

6、）Trypton2%dextrose (glucose)2%+agar2%+Zeocin100jjg/ml液体 YPD培养基可常温保存，是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD平板在 4C可保存几个月。加入 Zeocin 100ug / ml ，成为 YPDZ 培养基，可以 4C条件下保存 12周。2.4BMGY 培养基Yeast extract1%Peptone2%磷酸钾缓冲液（ pH6.0 ) 100mmol/LYNB1.34%Biotin(4X10 -5 ) %Glycerol1%毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB 和 Biotin 过滤除菌。培养 24 小时后，一 般静置过夜，待酵母沉淀后倒

7、掉 BMGY 培养基，改换 BMMY 培养基，进入诱导表 达阶段。2.5BMMY 培养基Yeast extract1%Peptone2%磷酸钾缓冲液（pH6.0 ） 100mmol/LYNB1.34%Biotin（4X10 -5 ） %NaCl0.5methanol3%毕赤酵母诱导表达培养基，YNB 和 Biotion 过滤除菌。摇瓶培养时每 24 小时 之后加入 3%的甲醇诱导，一般诱导 72 小时。2.6YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Mediumyeast extract1%peptone2%dextrose （gluco

8、se） 2% sorbitol 1 M+agar2%+ Zeocin100 g/ml不管是液体 YPDS养基，还是 YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放 4 C条件下，有效 期 12 周。2.7MGYMinimal Glycerol Medjum（最小甘油培养基）（34%YNB 1 知油；4*10-5旅物素）。将 800ml 灭菌水、100ml 的 10*YNB母液、2ml 的500*B母液和 100ml 的 10*GY母液混匀即可，4C保存，保存期为 2 个月。2.8MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine（最小甘油培养基 + 0.004% 组

9、氨酸）在 1000ml 的 MG 藉养基中加入 10ml 的 100*H母液混匀，4C保存，保存期为 2 个月。2.9RDRegeneration Dextrose Medium（葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2 咐萄糖；1.34%YNB 4*10-5旅物素；0.005%氨基酸）1.将 186g的山梨醇定容至 700ml，高压灭菌；2.冷却后于 45 C水浴；3.将 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB; 2ml 的 500*B; 10ml 的 100*AA 等母液和 88ml 无菌 水混匀，预热至 45C后，与步骤 2的山梨醇溶液混合。4C保存。2.10R

10、DHRegeneration Dextrose Medium + Histidine（葡萄糖再生培养基 + 0.004% 组氨酸）在 RD培养基配制的第三步中，在加入 10ml 的 100*H母液，同时无菌水的体积减少至 78ml 即可，其余配制方法与 RD 相同。4C保存。2.11RD及 RDH平板的制备1.将 186g的山梨醇和 1520g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60C水浴:2.参照 RD/RDH 夜体培养基配制的步骤 4， 将 100ml 的 10*D、 100ml 的 10*YNB; 2ml 的 500*B ; 10ml的 100*AA等母液、（10ml 的 100*

11、H母液）和 88 （78） ml 无菌水混匀，预热至 45 C 后，与步骤 1的山梨醇/琼脂液混匀；3.迅速制备平板。4C可保存数月。2.12RD及 RDH的 TOP琼脂的制备（常用丁酵母菌的包被）1.将 186g的山梨醇和 7.510g 琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60C水浴；2.参照 RD/RDH 夜体培养基配制的步骤 4,将 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB; 2ml 的 500*B ; 10ml的 100*AA等母液、（10ml 的 100*H母液）和 88 （78） ml 无菌水混匀，预热至 45C 后，与步骤 1 的山梨醇/琼脂液混匀；3.将

12、该 TOF脂置于 45 C水浴冷却、保温，备用。2.13MD 与 MDHMinimal Dextrose Medium +（ Histidine ）最小葡萄糖培养基 + （ 0.004 % 组氨酸）（含有：1.34%YNB； 4*10-5%生物素；2 淘萄糖）1.100ml 的 10*YNB; 2ml 的 500*B 和 100ml10*D 母液，用 800ml 的无菌水定容至 1000ml 即可；2.如配制 MDH 可在上述的 MD中加入 10ml 的 100*H 即可；3.如配制平板，可无囹水的灭囹前，加入1520g的琼脂。4C可保存数月。2.14 SOC土口.Tryptonl%Yeast

13、 Extract0.5%NaCl0.05%Glucose （1mol / L） 2%121 C高压灭菌 20min，冷却后，4C保存。母液的配置注：10*YNB（含有硫酸铉、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4 C 保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铉）+100g硫酸铉，溶于 1000ml 水中，过滤除菌。500*B（0.02%尘物素 Biotin ） 4 C 保存保存期为 1年。20mg的生物素溶于 100ml 水中，过滤除菌。100*H（0.4%Histidine 组氨酸）4 C 保存 保存期为 1 年。400mg 的 L-组氨酸溶于100ml 水中，（加热至 50C 以促进溶解），过滤除菌。10*D（20%Dextrose葡萄糖）保存期为 1年。200g葡萄糖溶于 1000ml 水中，灭菌 15min或过滤除菌。10*M（5%Methanol甲醇）保存期为 2个月。将 5ml 的甲醇与 95ml 水混匀，过滤除菌。10*GY（10%Glycerol 甘油） 保存期为 1年以上。将 100ml 甘油和 900ml 水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。100*AA(0.5% of each Amino