临床细菌学检验

1、第一部分：标本分类、每一类标本采集注意事项、涂片及鉴定结果解读；第二部分：药敏结果解读；第三部分：难鉴定细菌真菌分子鉴定新技术。细菌标本类别细菌标本类别标本明细标本明细容器容器1 1 静脉血静脉血静脉血、静脉血、骨髓骨髓血液培养瓶血液培养瓶2 2 中段尿中段尿无菌尿杯无菌尿杯条码开头条码开头20203 3 粪便粪便灰色头短管粪便容器灰色头短管粪便容器4 4 痰液痰液无菌痰盒无菌痰盒抽吸痰专用痰盒，手工抽吸痰专用痰盒，手工贴条码贴条码条码开头条码开头20205 5 咽拭子咽拭子无菌拭子管无菌拭子管条码开头条码开头2020细菌标本类别细菌标本类别标本明细标本明细容器容器6 6 穿刺液穿刺液（说明标

2、本部（说明标本部位）位）6.16.1胸水、腹水、胸水、腹水、关节腔液、引流液关节腔液、引流液，脑脊液，深部脓液脑脊液，深部脓液、腹透液等各部位、腹透液等各部位穿刺液穿刺液无菌拭子管无菌拭子管（胸腹（胸腹水、关节腔液、引水、关节腔液、引流液等需加肝素抗流液等需加肝素抗凝凝）或直接将注射器送或直接将注射器送检，手工贴条码检，手工贴条码条码开头条码开头2020细菌标本类别细菌标本类别标本明细标本明细容器容器7 7 分泌物分泌物（说明标本部（说明标本部位）位）7.17.1前列腺液、尿道前列腺液、尿道、阴道、宫颈口等生、阴道、宫颈口等生殖道分泌物殖道分泌物无菌拭子管无菌拭子管条码开头条码开头20207.

3、27.2伤口分泌物伤口分泌物无菌拭子管无菌拭子管条码开头条码开头20207.37.3各部位组织块各部位组织块无菌拭子管无菌拭子管条码开头条码开头20207.47.4气管、食道等部气管、食道等部位刷片位刷片刷片盒刷片盒细菌标本类别细菌标本类别标本明细标本明细容器容器8 8 器械器械8.18.1气管插管气管插管 无菌拭子管无菌拭子管条码开头条码开头20208.28.2动静脉插管、各动静脉插管、各部位引流管部位引流管无菌拭子管无菌拭子管条码开头条码开头20208.38.3各种输液反应液各种输液反应液体，医院感染监测体，医院感染监测物品的无菌试验物品的无菌试验 直接送检相应物直接送检相应物品品8.48

4、.4空气监测，物表空气监测，物表监测，医护人员手监测，医护人员手培养培养 到细菌室取培养到细菌室取培养皿或含培养液的皿或含培养液的无菌试管无菌试管一、血液标本病原菌检验一、血液标本病原菌检验 目前我国社会老龄化日趋严重，慢性病及恶性肿瘤、器官移植、爱滋病和结核病病人不断增多，侵袭性诊疗技术广泛应用，败血症发病率不断增加。 败血症病死率30%以上；早期病原学诊断和合理抗生素治疗，明显降低败血症病死率。血液培养的送检指征：血液培养的送检指征：发热38或低温10109/L，“核左移”白细胞增多；粒细胞减少，成熟的多核白细胞90次/分；呼吸频率20次/分；二氧化碳分压32mmHg；昏迷；多器官衰竭。

5、最好在抗生素使用前采集，若已用抗菌药须，则尽量避开血药浓度的高峰期； 建议第一次可在病人发热初期或高峰期采集，根据病人发热情况，在24h内再取2-3份标本，以提高病原菌检出率。血液标本采集的注意事项：标准血培养瓶（蓝色帽）：帽子和标签纸左上方为蓝色，“Standard 10 Aerobic/F”，用于成人需氧菌和真菌培养，血液量3-10ml ，8-10ml最佳。 中和抗生素的树脂瓶（灰色帽）：帽子和标签纸左上方为灰色，“PLUS+Aerobic/F” ，血液量3-10ml ，8-10ml最佳。厌氧瓶（黄色或橘红色帽）：帽子和标签纸左上方为黄色，“Standard Anaerobic/F”，血液

6、量3-7ml ，5-7ml最佳。 中和抗生素的儿童瓶（粉红色帽）：帽子和标签纸左上方为粉红色，“PEDS PLUS/F”, 血液量1-3ml。 采集标本前先开申请单，到检验科细菌室或门诊领取血培养瓶； 采血前先在培养瓶标签纸左侧空白处（箭头所指处）填写抽血时间和病人科别、床号和姓名； 不要在培养瓶条形码上涂写，以免影响扫描。将标签纸上条形码右侧部分（含数字）撕下贴于检查申请单上；而其它标本均是将申请单上双联号码撕下贴于标本上。注射器采血后，将血培养瓶帽子揭下，橡皮由金属皮（围脖）固定于瓶上；将橡皮塞用70%酒精消毒，注射器针头刺穿橡皮塞将血注入培养瓶内；橡皮塞裸露即可。 细菌室接到已采集血液的

7、培养瓶后，立即放入自动血液培养检测仪，自动培养及实时检测。阳性初步结果报告： 仪器阳性报警，90%以上阳性标本24h内检出； 取出阳性瓶，对血液涂片及革兰氏染色； 立即将涂片结果（G+、G-细菌，球菌或杆菌，或真菌）电话通知相应科室，并在网上发出； 利用阳性血液进行K-B法药敏试验，第二天将初步药敏结果电话通知相应科室。结果报告形式结果报告形式血液涂片血液涂片血液涂片血液涂片血液涂片血液涂片阳性最终结果报告： 将阳性血液接种血平板培养细菌； 第二天将血平板上生长的细菌鉴定及MIC法药敏试验；第三天发鉴定及MIC法药敏结果的正式报告。阴性结果报告： 如培养5天仍为阴性，再接种血平板培养一天，核实

8、为阴性后再发报告。结果报告形式结果报告形式二、中段尿标本病原菌检验二、中段尿标本病原菌检验 检测泌尿系统感染； 一般进行细菌和真菌培养、菌落计数和药敏； 也可离心后对沉渣进行涂片检查，革兰染色或抗酸染色； 也可用于淋球菌培养和涂片检查。目的和意义 最常采集中段尿，晨起第一次尿送检最佳； 先用肥皂水、或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗女性外阴部及尿道口或男性尿道口，再用灭菌水清洗，最后用灭菌纱布檫拭；排尿弃去前段尿，留取中段尿约10ml于无菌容器内加盖送检。采集方法 尿道病原菌可在温暖尿液中繁殖，中段尿标本采集后应尽快送检，否则将影响病原菌计数的准确性； 排尿困难者可导尿，避免多次导尿所致尿路感染

9、，导尿包必须为无菌的合格产品。采集方法不染色涂片尿沉渣真菌 中段尿中段尿“培养出3种以上细菌，疑采集污染，重留标本”： 如培养出3种或以上细菌，且无优势菌；约10%的标本不合格，采集时污染，采集中段尿（尤其女性）最好由专门医护人员指导采集，以减少污染。结果报告形式“培养出少量某种细菌、菌落计数结果”： 如菌量较少 103ml，但为单一菌种，可能为采集时污染，也可能是真正的感染，临床医生可根据病人临床表现判断或再留取标本送检。结果报告形式“培养出某种细菌、菌落计数结果、药敏结果”： 一般认为细菌或真菌105ml ，且必须有优势，才可以确定为感染，对优势菌进行鉴定和药敏。 104ml至105ml，

10、也有意义。 结果报告形式三、粪便标本病原菌检验三、粪便标本病原菌检验 对肠道感染进行病原学诊断。 涂片革兰染色查细菌、球/杆菌比、真菌。 涂片暗视野查弧菌；抗酸染色。 培养沙门氏和志贺菌；培养弧菌；培养真菌； 菌群失调病人，对占优势细菌进行鉴定药敏。 标本采集： 挑取含脓、血或粘液粪便约2-3g； 置于清洁容器或置于保存液中送检； 排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子采集。 检查上下呼吸道感染 痰液（下呼吸道）和咽拭子（咽喉部）； 可进行涂片查细菌、真菌或抗酸杆菌； 可进行细菌、真菌或结核杆菌培养； 上述检查只要一口痰即可，在一张检查申请单上选上述多个项目。四和五、呼吸道标本的病原菌检验四和五、呼吸

11、道标本的病原菌检验 采集深部痰，不是唾液和口水。 自然咳痰法，最好为清晨第一口痰，用清水反复漱口用力咳出第一口痰于无菌容器内； 支气管镜采集法。采集方法采集方法 痰液痰液痰液痰液痰液痰液 全球每年增加结核病人约800万1000万，死亡病人约300万；我国高发，广东也较高; 结核分枝杆菌菌体表面含脂质成分，不易着色，但一经着色后，在酸或乙醇的作用下也不容易脱色； 抗酸性菌呈红色，其它细菌及细胞等背景呈蓝色； 油镜下查遍整个涂片，或至少100个视野。涂片抗酸染色：检查抗酸杆菌 1984年国内统一暂行规定报告方式： 未找到抗酸杆菌； 找到抗酸杆菌1或2个，全视野发现1或2个； 找到抗酸杆菌 +，全视

12、野发现3-9个； 找到抗酸杆菌 +，全视野发现10-99个； 找到抗酸杆菌 +，每视野发现1-9个； 找到抗酸杆菌 +，每视野发现10个以上。 涂片抗酸染色：检查抗酸杆菌报“正常菌群”： 培养出的均为不致病的细菌； 培养出的细菌种类较多且无优势菌。报“无菌生长”：病人抗生素使用过度导致。结果报告形式结果报告形式 报“分离出某种细菌或真菌，比例，药敏”： 分离出致病菌，而不是常见的正常菌群，且具有优势，约占血平板菌群总数的百分比%； 同一病人如痰中连续分离出同一种菌，3天内如果已经做过药敏试验，则不再做药敏； 同一病人痰中细菌的种类和比例，会随着治疗情况变化，也受留取痰标本的质量影响。结果报告形

13、式结果报告形式 六、穿刺液（脑脊液）病原菌检验六、穿刺液（脑脊液）病原菌检验 脑脊液采集：通过腰椎穿刺术（Lumber puncture）以无菌操作采集脑脊液3-5ml于无菌小瓶或无菌试管中，一般第一管用于病原菌检验，第二管用于理化检验，第三管用于细胞学检验。六、穿刺液（脑脊液）病原菌检验六、穿刺液（脑脊液）病原菌检验 引起脑膜炎的病原体脑膜炎奈瑟菌等抵抗力弱，不耐冷，故采集的脑脊液应立即保温送检或床边接种。 可查一般细菌真菌、隐球菌、抗酸杆菌。 新生隐球菌广泛分布于自然界，可存在人体体表、口腔及肠道； 经呼吸道侵入人体，由肺经血行播散时，可侵犯所有脏器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜； 好发于细胞

14、免疫功能低下者，如AIDS、恶性肿瘤、糖尿病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者； 临床上怀疑隐球菌性脑膜炎时，常抽取脑脊液进行墨汁染色。墨汁染色查隐球菌 脑脊液离心3500r/m，10分钟；弃上清，沉渣涂片； 墨汁染色时，先取一玻片，编号，先滴1滴印度墨汁，再将沉渣涂片，将适量墨汁和沉渣混匀，盖上盖玻片； 将显微镜视野调暗，先用低倍镜观察全片，再用高倍镜观察可疑的细胞； 必须找到典型形态的隐球菌，荚膜清楚，大小不一，有出芽等； 非致病性隐球菌无荚膜。墨汁染色查隐球菌墨汁染色新型隐球菌 其它穿刺液：如胸腹水、关节腔液等，穿刺针注入无菌试管送检或将注射器直接送检； 如为多管穿刺液或相关组织，请在申

15、请单上注明是否都做培养鉴定； 采集注意事项：注意无菌操作；如培养出类白喉杆菌，常为采集时污染所致；可用血液培养瓶培养。七、分泌物（伤口或脓液）病原菌检验七、分泌物（伤口或脓液）病原菌检验 开放性化脓灶：应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用棉拭子蘸取或注射器吸取脓性分泌物。 瘘管内脓液：先用灭菌棉拭子挤压瘘管弃去前端脓液，再收集脓汁。七、分泌物（伤口或脓液）病原菌检验七、分泌物（伤口或脓液）病原菌检验 封闭性脓肿：可用注射器穿刺抽取。 疑为厌氧菌感染者：取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检；外界相通部位的标本，如痰不能作厌氧菌培养。七、分泌物（生殖道）病原菌检验七、分泌物（生殖

16、道）病原菌检验 性传播疾病，简称性病，是一组通过性行为传播的，侵犯皮肤、性器官和全身多脏器损害的感染性疾病。 标本采集：常取生殖道分泌物，男性取尿道口分泌物或前列腺液，女性取外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物等。G-双球菌白带淋病 涂片染色镜检： 急性淋菌性尿道炎敏感度和特异度高达90%以上；对慢性无症状淋病的女性患者涂片检查漏诊率达40%，故必须同时进行培养。 培养鉴定及药敏结果准确，诊断金标准。解脲/人型支原体： 开展了培养鉴定及药敏试验； 需注意的是标本采集后应尽快送检。 诊断试剂和方法要符合卫生部相关规定； 注意保护病人的隐私。八、器械病原菌检验八、器械病原菌检验 静脉插管等标

17、本：放入无菌试管中送检； 无菌试验：怀疑医疗用品被污染时送检； 空气培养：到细菌室取培养平皿置于待测地点，打开平皿盖10min，盖上后送检； 医护人员手培养和物表培养：到细菌室取含消毒剂中和液的无菌试管，用棉签涂抹后放入试管中送检。第一部分：标本分类、标本采集注意事项、涂片及鉴定结果解读；第二部分：药敏结果解读；第三部分：难鉴定细菌真菌分子鉴定新技术。 稀释法（dilution method）和K-B纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer disc agar diffusion method）； 稀释法的结果比K-B法的更准确。 本实验室利用细菌自动鉴定和药敏仪，为稀释法药敏试验，由仪器自动判

18、断药敏结果。 药敏检测的方法药敏检测的方法 根据临床实验室标准化委员会（clinical laboratory standards of institute, CLSI）标准判断 敏感（susceptible，S）：推荐使用； 中介（intermediate，I）：药物MIC接近体液或组织可达到药物浓度，但反应低于敏感株； 耐药（resistant，R）；指常规用药剂量不能达到MIC，临床疗效不可靠。药敏检测的方法药敏检测的方法抗菌药物的作用靶位氨基糖甙类：阿米卡星Amikacin、庆大霉素Gentamicin1代头孢：头孢唑啉Cefazolin2代头孢：头孢呋辛钠Cefuroxime sod

19、ium3代头孢：头孢他啶Ceftazidime、头孢噻肟Cefotaxime、头孢吡肟（马斯平）Cefepime细菌室药敏试验中常选用的抗生素种类单环-内酰胺类：氨曲南Aztreonam广谱青霉素类：氨苄西林Ampicilin、青霉素G Penicillin、苯唑西林Oxacillin 抗假单胞菌广谱青霉素：哌拉西林Piperacillin复方-内酰胺类：阿莫西林-克拉维酸（奥格门丁）Amoxicilin/clavelanate、氨苄西林-舒巴坦（优力新）Ampicillin/Sulbactam、哌拉西林-他唑巴坦（特治星）Pioeracillin/Tazobactam、头孢哌酮-舒巴坦（舒普

20、深）efoperazone/Sulbactam碳青霉烯类：亚胺培南Imipenem、美罗培南Meropenem多肽类：多粘菌素E Colistin E、替考拉宁Teicoplanin、万古霉素Vancomicin磺胺类：复方新诺明（甲氧苄唑-磺胺甲唑）Timethoprim/Sulfamethoxazole林可霉素类：克林霉素Clindamycin大环内脂类：红霉素Erythromycin氯霉素：氯霉素Chloramphenicol三代喹诺酮：环丙沙星Ciprofloxaxin 、氧氟沙星Ofloxaxin 、左旋氧氟沙星Levofloxacin 、莫丙沙星Moxifloxacin四环素类：四

21、环素Tetracycline利福平Rifampin 产超广谱-内酰胺酶(extended spectrum-lactamase，ESBL)：该酶水解青霉素、头孢菌素及单胺类的超广谱-酶，主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生； CLSI规定， ESBL确认试验（+） ：则对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南均应报告耐药，而不考虑体外药敏结果，建议用碳青霉烯类抗生素。 耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistance staphylococcus，MRS）， CLSI规定，葡萄球菌如对苯唑西林（或甲氧西林）耐药：对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和含酶抑制剂的复方制剂均应报告

22、耐药，而不考虑体外药敏结果。 耐高浓度庆大霉素肠球菌（High level aminoglycosides resistance in Enterococcus） CLSI规定，肠球菌引起的全身性严重感染，常联合应用-内酰胺类和氨基糖肽类抗生素，如果肠球菌对高浓度庆大霉素耐药，则联合用药无效。3、临床分离菌株的分布和药敏分析利用WHO提供的WHONET软件，建立细菌耐药监测数据库。可以对不同时期、不同科室、不同属种、不同类型标本等的资料分别进行分析。下面介绍本院09年细菌耐药资料分析结果。第一部分：标本分类、标本采集注意事项、涂片及鉴定结果解读；第二部分：药敏结果解读；第三部分：难鉴定细菌真菌

23、分子鉴定新技术。临床常见细菌鉴定要点临床常见细菌鉴定要点G+球菌G-球菌G-杆菌G+杆菌氧化酶，O/F肠杆菌科非发酵菌分枝杆菌菌落特征、革兰/抗酸染色触酶葡萄球菌+肠球菌-链球菌-触酶，氧化酶奈瑟菌+布兰汉菌+4糖：葡乳麦蔗DNA， N硝还临床常见G+球菌鉴定要点葡萄球菌链球菌肠球菌触酶+触酶触酶金葡溶血凝固酶+溶血葡溶血凝固酶-表皮葡不溶血凝固酶-肺炎链溶血奥扑托辛S化脓链溶血杆菌肽S无乳链溶血CAMP+高盐七叶苷阿拉伯糖屎肠阿+粪肠阿-发酵菌氧化/发酵，+/+肠杆菌科例外：非发酵菌氧化/发酵，+/-不动杆菌：G-球杆菌；嗜麦芽寡养单胞菌：菌落黄色。例外：发酵菌氧化/发酵，+/+弧菌属非发酵

24、菌氧化/发酵，+/-假单胞菌属氧化酶-氧化酶+临床常见G-杆菌鉴定要点O/F，KIA肠杆菌科生化O/F非发酵菌生化血清学鉴定O157：H7、沙门菌属、志贺菌属血清学鉴定临床分离细菌真菌中，有少部分通过传统生化反应和表型方法难以鉴定，给临床诊断和治疗带来困难。目前细菌真菌核糖体基因序列分析，已经成为分类的金标准。随着分子生物学技术的飞速发展，根据细菌和真菌基因组的特点，对它们的核糖体基因进行扩增并测序，可以准确阐明难鉴定病原菌的属种。细菌的16S rRNA编码基因由保守区和可变区组成，保守区为细菌共有，细菌间无差别,可变区具有属种差异。真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因由保守区和

25、可变区组成，它们之间的ITS2区域也有属种差异。本研究利用通用引物扩增分别扩增细菌的16S rRNA基因和真菌核糖体的转录间隔区2（ITS2），对PCR产物进行测序，将序列结果在GenBank进行Blastn比对。具体方法略，相关研究即将发表。 本研究从血液中检出2例临床不常见细菌。1例是生痰二氧化碳嗜纤维菌，G-球菌，是人类口腔的正常菌群，属于条件致病菌，常通过口腔粘膜进入血液，感染者大多患有血液系统恶性肿瘤或粒细胞减少等疾病。该例患者岁，男性，诊断为地中海贫血，来自小儿科层流病房。另外1例是根癌农杆菌，G-杆菌，普遍存在于土壤，生活在植物根的表面，依靠由根组织渗透出来的营养物质生存，能诱发

26、植物产生肿瘤，一般应用于植物的转基因研究。该例患者20岁，女性，诊断为急性胰腺炎，来自消化内科。上述2例细菌引起的败血症国内文献未见报道，国外有4例病例报道。本研究检出4例临床难鉴定真菌。第1例是马尔尼菲青霉菌，常感染艾滋病患者，本病多见于东南亚。该例患者39岁，男性，艾滋病抗体阳性，以肺炎收治于感染科。第2例是Arxiozyma telluris，属于产孢子酵母菌，首次从南非土壤分离得到，大都感染啮齿类动物和鸟类，较少感染人、猪、牛。此例标本来源是痰液，与白色念珠菌混合感染。该例患者82岁，女性，以肺部感染收治于呼吸内科。第3例是黑曲霉菌，标本来源是患者耳部脓液。该例患者25岁，女性，就诊于耳鼻喉门诊，诊断为慢性化脓性中耳炎，国内文献报道耳部真菌感染的主要病是黑曲霉菌。第4例是镰孢菌，标本来源是眼部分泌物。该例患者48岁，女性，诊断为角膜炎，来自眼科。我国镰孢菌所引起的真菌性角膜炎占真菌性角膜炎体的近