免疫组化试验步骤

1、TTA standardization office TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C石 蜡 切 片 免 疫 组 化 实 验 步 骤 石蜡切片步骤根据晓峰整理的步骤进行(From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片方案)：1)材料的准备在本实验室条件下推荐使用FAA (50% ethanol, 5% acetic acid, %甲 醛)固定材料.FAA固定液(100ml),室温保存：无水乙醇冰醋酸37%甲醛水50ml5 ml10ml35 ml第一天：组织固定用FAA固定,详见石蜡切片 protocoL第二天：脱水Solutiontimenumber of changes50% ethan

2、ol?60 minutesone60% ethanol?60 minutesone*70% ethanol?60 minutesone以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4°C冰箱等待,并不时轻摇.*组织可在70% ethanol 4°C可存放几个月第三天：进一步脱水和浸蜡以下所有步骤在4°C进行并不时轻摇Solutiontimenumber ofchanges85% ethanol60 minutesone95% ethanol60 minutesone以下所有步骤在室温进行并不时轻摇Solutiontimenumber ofchanges100% ethanol

3、30 minutestwo100% ethanol60 minutestwo25%二甲苯,75% ethanol?30 minutesone50%二甲苯,50% ethanol?30 minutesone75%二甲苯,25% ethanol+番红30 minutesone100%二甲苯60 minutestwo100% 二甲苯 + 1/4 volume ParaplastPlus (paraffin) chipsovernight(不要摇动)准备工作：60°C预热plus蜡片(Paraplast Plus)石蜡可反复融凝而去气泡第四天：浸蜡2将材料置于42°C直至蜡块完全熔

4、化.再加1/4体积的蜡块至完全熔化 后移至60°Co几个小时后换上新鲜熔好的蜡液,过夜.第五天：浸蜡3换蜡两次(Paraplast Plus ) 第六天：浸蜡4换蜡两次(Paraplast Plus )第七天：浸蜡5换蜡两次(Paraplast Plus )准备工作：60°C预热 Regular 蜡片(Paraplast Regular)第八天：包埋(包埋块可长久保存)第九天及之后：开始切片,切片应包括自己的片子及正负对照等.事先翻开烘片机至37 度,在涂有多聚赖氨酸的玻片上加l2ml的蒸徭水.切好的片子轻至于加 水的玻片上.待所有片子准备完之后盖上盖子,烘片过夜.用自来水

5、及双蒸水清洗免疫组化专用塑料,放在烘箱烘干待用.第二天：开始脱蜡(From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片protocol)Solutiontimenumber of changes100%二甲苯10 minutestwo100% ethanol1-2 minutestwo95% ethanol1-2 minutesone90% ethanol1-2 minutesone80% ethanol1-2 minutesone60 % ethanol1-2 minutesone30 % ethanol1-2 minutesonewater1-2 minutesonePBS(PH=5 minuteson

6、ePBS(PH=5 minutesone(用新买来的免疫组化塑料小盒,每一步只需参加试剂220-250毫升)抗原修复：在切片还浸入酒精时,可以事先将煮锅清洗干净,用蒸徭水洗12遍, 最后参加柠檬酸钠缓冲液(PH=,煮沸(保持在95度左右),将过完PBS的 片子让入煮沸的锅中,煮片10-15 mine然后将电磁炉关闭,自然冷却锅 中切片(千万不要把片子拿出来,放在缓冲液中一起自然冷却至室 温！ ！)将片子浸入PBS (PH=) 5 mino重复一遍.封闭：在抗原修复时可以事先配制封闭液,用PBS (PH=)配制3% BSA的封 闭液.将PBS中的切片放入封闭液中,室温放置30分钟1小时.杂一抗：

7、在封闭时可先剪好与切片大小相当的封口膜,并准备加有少量水的塑料 大盒,用卫生纸垫在塑料大盒中附带的塑料板上.用封闭液稀释一抗(GFP 兔多抗以1:100稀释,其它一抗需要另外尝试).将稀释完的一抗加在片子 上,每张片子保证不少于lOOul,用封口膜封上,检查是否有汽泡,轻轻 赶走气泡.将片子放在塑料大盒中,盖上塑料盖子,放入冰库过夜. 杂二抗：事先配制好TBS(PH=缓冲液,用TBS (PH=)缓冲液稀释带有碱性磷酸 酶(AP)标记的抗兔二抗,比例为1:200o将塑料大盒从冰库中拿出,浸入 TBS (PH=)缓冲液中洗一抗,5min,重复3次,在洗一抗的过程中准备 封口膜.将片子上的剩余缓冲液

8、倒去(但片子必须保持湿润！ ！)每张 片子加不少于lOOul的二抗稀释液,盖上封口膜,放入塑料大盒中,室温 放置1小时.洗二抗并显色用TBSPH=缓冲液洗二抗,5min,重复3次.同时在暗处配制显色液40ul溶液A+40U1溶液B+720U1水,可根据实际切片数量按比例配制显 色液,剪切封口膜.将片子至于暗处,倒去缓冲液,每张片子加不少于lOOul的显色液,轻 轻盖上封口膜,放于暗处进行显色.每隔15分钟左右看一下片子是否开 始显色根据经验,参加显色液30minl小时会开始显色,但是需要根据不 同蛋白表达强弱,把握显色时间.发现显色之后需加蒸镭水终止反响, 再盖上盖玻片进行观察并拍照.试剂:1. PBS (PH=):购置