ABI3500xL基因分析仪操作流程

1、ABI 3500 xLg 因分析仪操作流程一、标准测序反响(一)质粒测序标准实验流程1.对质粒DNA的质量和浓度要求纯度：OD 260/OD 280= 1.62.0，用量：每反响150300 ng。2.测序PCR反响标准反响体系：试剂_用._； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ；质粒 D D NANA (200(200 ng/pL)ng/pL)1 1 nLnL.火向去 W水10 uL总体积20ML96 C 1 min (96nC 10 sec 50 C 5 sec 60 P4 min) x 25个循环t 4 P保温3.测序产物纯化：使用Edge Bio收集柱进行纯化。(

2、1)离心850g, 3min柱子，弃掉收集管，换新的EP管。(2)将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上。(3)离心850g, 3min,弃掉柱子，即得纯化产物。(4)取10 L Hi-Di Formamide入96孔板中，再参加10两寺测样品，振荡混匀离心。(二)PCR产物测序标准实验流程1 .对PCR产物的要求纯度：OD 260/ OD280=1.62.0，用量：每反响10100 ng。强烈建议在测序前，先 纯化PCR产物。2.PCR产物的测序PCR反响标准反响体系：豌化的PCR产物(lOng/pL)BigDye (2.5 K)引物(32pfnol/pL)火仙上离水总体相96

3、C 1 min (96 CIO sec 50 C 5 sec 60 P4 Ein) x 25个循环-4 Pi*温3.测序产物纯化：方法同上。二、上机测序(一)启动系统1.翻开电脑，检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动。2.翻开3500 xL仪器电源，等待仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。8此1此10 uL20 nL3.启动电脑桌面DataData collectioncollection softwaresoftware。4.检查维护提醒：浏览维护提醒，假设已完成点击。5.检查耗材状态：点击“RefreshRefresh，更新后检查仪表盘上各种耗材的状态(POP7、ABGCB

4、C和毛细管)，假设指示针在可用范围内那么可继续，假设在指示针在红色区域中，那么需更 换耗材后再继续。6.仪器预热：点击仪表盘上的“StartStart Pre-heatPre-heat按钮预热炉子和泳道。二放置待测样品1.检查确保橡胶隔板 均通透后，将其小心盖在加有待测样品的96孔板上，注意孔对孔盖好。2.将板子放入板架中，盖好固定盖，确保所有孔都一一对齐，即组装好测序板子。3.按仪器的TRAYTRAY按钮，使托盘出仓，之后将组装好的板子放入自动采样器中，注意有标记 的一侧面对操作者。三创立平板1.点击CreateCreate PlatePlate FromFrom TemplateTempl

5、ate在弹出对话框中选择模板Std_Seq_Array_xL_POP7Std_Seq_Array_xL_POP7点 击Open,Open,输入详细的平板信息，包括Name,Name, NumberNumber ofof Wells,Wells, PlatePlate Type,Type, CapillaryCapillary Length,Length, PolymerPolymer。一般详细如下。lilu： Nw Plate , t * Open PlateT|_ Save Pldte t 1 Close Pla1.点击屏幕下方的AssignAssign PlatePlate Content

6、sContents1输入各个孔的样品名称等信息，ResultsResults groupgroup输入结果的保存路径。2选中下面控制面板上Assay,Assay, FilenameFilename convention,convention, ResultsResults groupgroup三个工程。3点击LinkLink PlatePlate forfor RuiRui OKOK。2.检查屏幕上显示的各种信息，确定正确无误后点击StartStart Run,Run,即启动运行。四监控运行仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况。1.可查看选中的单孔或某一排的运行情况，查看Instrument

7、Instrument RunRun ViewsViews andand FlagsFlags中各项:EPT电流、电压、温度，ArrayArray中可查看峰图。2.可编辑进样列表：重复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作。3.启动、暂停或继续运行。五查看结果点击ReviewReview ResultsResults即可查看原始的测序结果，分析结果方法见下。三、分析测序结果1.翻开软件：双击电脑桌面2.导入结果：点击工具栏中SequencingSequencing AnalysisAnalysis v5.4Bv5.4B标。AddAdd samplessamples 按钮，选择路径，导入待分析的

8、测序结果。分析：SampleSample managermanager中选择分析方法对测序结果进行分析。 果翻译为对应的碱基序列。3.般用BCBCbaseclling,将原始结(1)(2)选中BCBC复选框，点击工具栏中StartStart analysisanalysis分析结束后，结果将自动保存为ab1ab1格式文件。按钮，即开始分析。Pfate Details点击工具栏中AnalysisAnalysis reportreport按钮，可查看结果状态BC status,不同颜色代表(3)不同测序结果，可判定本次测序成功与否。AnalysisAnalysis StatusStatus Leg

9、endLegendSuccessSuccess J J SuccessSuccess withwith warningwarning F F日ilil 3 3 ErrorError Q Q UntlssifdUntlssifd . .(4)选中某样品前showshow复选框，即可查看各样品的详细结果。A.sequencesequence显示碱基序列及其QV评分结果。注意：a.蓝色：High QV = 20+,结果可信；黄色Medium QV = 15 to 19 ,需查看峰图，判定结 果是否可信；红色Low QW 15,结果不可信。b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保存到txt文档中。

10、B.ElectropherogramElectropherogram显示电泳峰图及序列。C.RawRaw显示看到原始电泳图。4.打印：SampleSample managermanager中选中P P (print)复选框，点击StartStart analysisanalysis绿色按钮，即可将测序结果 输出为pdfpdf格式文档。操作考前须知1.测序反响：(1)模板：测序反响对模板质量要求很高，一般需经纯化才可使用；模板用量也有规定。V PCftW1-J ng5 此5涕呻IQ-40 ng 2054 ng15000 ns- 大分子量模板BAC )*基因组。NA(2)反响体系： 一般用标准的反

11、响体系， 也可用稀释反响体系(比方序列比拟简单时) 般8倍以内稀释比拟可靠。(3)反响条件：退火50C和延伸60C时，升降温速度需降低至1C/s,使测序反响充分进 行。(4)体系配制：反响体系的制备不能在样品制备区和PCR区进行，移液器不能混用，否那么 会造成实验室污染。I 3500 xl日常维护1.毛细管维护：SDDklOOD命IDmOQDbp2顾M(1)每周查看阴极缓冲液的液面，防止毛细管露出液面枯燥而失效。假设液面下降，可在阴 极缓冲液中参加双蒸水，保证毛细管插入液面下。下次电泳前换新的缓冲液。(2)防止碰触毛细管针尖，只有在更换新的毛细管时才需翻开检测窗口门，之后需在软件中重新校正。包

12、括：A空间校正，maintainance calibrate speitial，选择fill灌胶后 开始，选择no fill不灌胶直接开始start calibrate。结果判定，所有峰只有一个尖且间距在15, 16间，峰高比拟均一，相差不超过60%可接受，完成后要点Accept或者reject B光谱校正，换新毛细管、不同类型试剂盒、不同类型胶时需做maintainance calibrater spectial , G5为片段分析用，Z为测序用calibrate run , chemistry standard : G5。完成后需点Accept o(3)假设长期不用仪器时，仍需每周给毛细管

13、灌胶一次。(fill array with polymer )2.仪器日常维护：(1)可用无尘纸巾、棉签和蒸储水擦拭仪器外表，勿使用有机溶剂，不能随意搬动仪器。(2)严禁在电脑上安装其他无关软件，不准用U盘拷贝数据，只能刻盘。(3)长期不用应将POP7胶取下加塑料塞放入4C冰箱，用漂洗袋代替。并每周进行一次replenish polymer。(换新胶袋后和每周一次)。(4)假设机器使用频繁应每周用contridationing regents清洗灌胶泵(wash pump and channels)一次。(5)fill array with polymer ,换毛细管后或认为灌胶有问题时重新灌。(6)shut down,长期不用时关闭仪器，慎用。(7)remove bubbles ,排气