整理单克隆抗体的制备纯化及鉴定

1、单克隆抗体的制备、纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑,它涵盖了细胞培养、细胞融合、 免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容.了解单克隆抗体制备的原理、主要步 骤和方法.二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖,但不能分泌特异性抗体；而抗原免 疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体,但在体外不能无限增殖.将免疫脾细胞与 骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞, 继承了两个亲代细胞的特性,既具有骨髓 瘤细胞能无限制增殖的特性,又具有免疫 B细胞合成和分泌特异性抗体的水平. 经在HAT培养基含有次黄嘌呤H、氨基喋呤A和胸腺嘧啶核苷T中进行选 择性培养,未融合的脾细胞因不能在体

2、外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断,又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶HGPRT,不能利用培养基中的次黄嘌呤完成 DNA的合成过程而死亡.只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,因此能在HAT培养基中存活和增殖.经过克隆选择,可筛选出能产 生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞, 在体内或体外培养,即可无限制地大量制备 单克隆抗体.三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、C02培养箱、倒置显微镜等.四、操作方法：1、抗原制备；一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原.A 可

3、溶性抗原蛋白质 以1mg/ml5mg/ ml的溶液加等量的弗氏完全 佐剂乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为 0.3ml0.6ml,间隔35周再同样注 射一次,10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验.一个月后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原0.2ml0.4ml,34天后,杀死小鼠取脾做融合用.B. 颗粒性抗原 如抗原来源方便, 可以不加佐剂而增加免疫次数, 缩短间隔 时间.例如用羊红血球免疫小白鼠,以1%浓度每只皮下注射0.2 ml,每周2次,共免疫58次,取脾前3天,再免疫一次即可.有人认为最后一次免疫剂 量要大,大到近于免疫耐受的程度更好.2、免疫动物；目前应用最广的是

4、小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好.就品系而言以 Balb/ c小白鼠应用最广,由于所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来.Balb/c系小白鼠必须用纯系的,雌雄均可,以 812周龄为宜.大白鼠也可,能产生较多量的单克隆抗体. 现在已经在小鼠杂交瘤的根底上, 开展了小鼠大鼠,小鼠人以及人人杂交瘤技术.免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一.正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的 B 淋巴细胞,一只纯种小白鼠估 计能产生1.0X1075.0X 107种不同的抗体.因此一只正常的小白鼠的脾细胞与 小鼠骨髓瘤融合, 只能有千万分之一的时机获得某一种特定抗体. 所以

5、为了提升 得到某种杂交瘤的时机,必须增强免疫,使产生特异性抗体的 B 淋巴细胞大量 增加.B 淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响. 有人认为处在 转化时期的 B 淋巴细胞可能更易于融合,而免疫以后 78天,虽然是抗体产生 的顶峰时期, 但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少. 故一般认为增强免疫 后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合.3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备； 脾细胞制备 免疫过的血清抗体滴度高的 Balb/c鼠,拉颈或用CO2处死小白鼠.(2) 将小鼠放于 70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾. 把脾放入5ml含有2.5% FCS的1640液中,冰浴下轻轻

6、洗去脾上的红血球.(4) 用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中.(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中. 以2.5%FCS1640充满离心管,并以400g离心7min10min (与此同时应 开始制备骨髓细胞).(7) 把沉淀用约 10ml 的新鲜培养液再悬浮.(8) 重复、步骤.(9) 计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80%为合格.骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白, 这样的瘤细胞融合后, 可能影 响或降低所分泌抗体的滴度, 所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤 细胞.选择骨髓瘤细胞的条件

7、： 该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品 系,以便两者的组织相容性抗原一致； 骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生丫 球蛋白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;生长速度快,繁殖时间短.目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：S194/5XXO BU1; SP2/ 0 Ag14 (简称 SP2); P2 X ? Ag8 6 5 3 (简称 653); FO 以653最为常用,它是由矿物油4甲基一15烷(Pristane,降植烷)诱发出来 的一种浆细胞瘤(Minerol Oil plasmacy toma,MOPC)并经过培育形成一株 8- 氮

8、鸟嘌呤有反抗力的亚系.骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195C液氮罐中,试验时复苏、 增殖、传代即可.由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶 处理.为了预防出现返祖现象,在融合前,可将培养基内参加15卩g/ml 8-氮鸟 嘌呤.取约1X 1076X 107对数生长期(即培养15h20h)的骨髓瘤细胞,在 室温离心(400g) 10min,沉淀以2.5% FCS1640液再悬浮并计数. 饲养细胞在体外的细胞培养中, 单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖, 必须参加 其它活的细胞才能使其生长繁殖,参加的细胞称之为饲养细胞( Feeder cell). 在细胞融合和单克隆的

9、选择过程中, 就是在少量的或单个细胞的根底上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞. 许多种类的动物细胞都可以 做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细 胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞. 应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲 养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境.腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠. 也可以是其他种 类的小鼠,女口 C57鼠,昆明小白鼠等.(1) 拉颈处死小鼠.(2) 70%酒精浸泡消毒10min.(3) 用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔.(4) 用注射器将4ml

10、11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉 1min仍用该 注射器回抽腹腔液体,参加离心管.(5) 1 000ry min 离心 10min.(6) 取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液.台盼蓝染色计数活细胞, 使每毫升含40万个活细胞.(7) 以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔 0.05ml,含2万个细胞,放 入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用.如果在融合后发现在培养 孔中饲养细胞数量少,那么可以在细胞换液时再参加一些.4、细胞融合；小鼠骨髓瘤M以在体外培养液中牛存并大员繁殖.经过用某种抗原免疫的小 鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体,但小鼠的 B淋巴细胞在一般培养某中不易存活. 如

11、将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的 B淋巴细胞在融合因子(聚乙二醇,P EG)作用下产生融合,那么融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性,又具 有B淋巴细胞分泌特异性抗体的水平,在 HAT选择培养基中可以选择得到杂交 细胞.这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生 长,从培养液上清中可以收集到大量某 B淋巴细胞产物一一单克隆抗体.(1) 、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液,将108小鼠脾细胞与1-5X 107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中,经1000转/别离心 7分钟；2、弃上清液,尽可能除得干净,用手指轻叩离心管底部,使沉淀混匀如糊状,离心管置

12、37C水中进行水浴一小烧杯中,准备融合；3、将37E水浴中保温的50%PEG1.0毫升实际应用0.7毫升用滴管缓慢滴 入离心管中,在60秒钟内滴完,在37E水浴中边滴边摇边离心管,使细胞保存 在混匀状态；4、加完PEG后,将细胞悬液放在37T水浴中静置90秒钟,立即在2 4分 钟内参加15毫升无血清的RPMI-1640培养基37C,开始要一滴一滴地加, 由于稀释使 PEG 停止作用.注意尽可能不搅动细胞；5、再经 100 转/别离心 10 分钟.弃去上清液,加 25 毫升 HAT 培养液,轻轻 混匀,将混悬液分装已有巨噬细胞的两个 24孔培养板中,每孔 0.5毫升；6、将培养板放在水蒸汽饱和

13、CO2孵箱中,37T孵育.CO2含量为5%;7、每 23天换一次 HAT 培养液,连续 2周观察杂交瘤细胞是否出现. 2周 后使用 HT 培养基.5、杂交瘤细胞的选择培养；6、杂交瘤细胞的筛选；7、杂交瘤细胞的克隆化；8、单克隆抗体的检定；9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；10、单克隆抗体的大量制备.五、关键步骤与考前须知：1 、整个制备过程需严格无菌2、细胞传代培养时注意适时更换培养液杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养, 收集上清液而获得大量的单一的克隆化 抗体.不过体外培养法得到的单克隆抗体有限, 其不能超过特定的细胞浓度, 且 每天要换培养液. 而体内杂交瘤细胞繁

14、殖可以克服这些限制. 杂交瘤细胞具有从 亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性. 如接种到组织相容性的同系小鼠或不 能排斥杂交瘤的小鼠无胸腺的裸鼠,杂交瘤细胞就开始无限地繁殖,直至宿 主死亡.产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆 抗体,这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的 1001 000 倍.利用免疫抑制剂,如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等,可以加速和促进肿 瘤的生长.1材料1经高压灭菌的降植烷.2Balb/c 鼠：58 周龄.3杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞.4RPMI1640 培养液5新生牛血清2操作方法于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,注射后19周内种植细胞

15、.2收取对数生长期的杂交瘤细胞,用5% FCS1640液洗涤一次,1 000r /min 离心 10min. 取样,用台盼兰染色,计活细胞数,重新用5%FCS1640液配成1.0 X 107细胞/ml的悬液.(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞,每只腹腔注射1ml (含1.0X107个细胞/ml ).(5) 接种后 10天左右时间肿瘤体积最大,此时可由腹腔抽取腹水,每隔 13天 取 1 次,可取 10 次.血清可由腋下动脉或心脏采血后别离.单克隆抗体的提纯1 材料(1) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl 缓冲液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7

16、.87.9TrisHCl 缓冲液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl 缓冲液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl 缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE 纤维素柱2操作方法(1) 小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后,于1.00X105转离心30min,去沉淀.(2) 在4C于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使溶液最终为50% 硫酸铵浓度.(3) 此溶液置冰中30min60min,然后5 000r/min离心10min,去上清.(4) 将沉淀溶于Tris HCI缓冲液(40mMol/L NaCI

17、)中(溶液可能混浊).(5) 装入透析袋于Tris HCl缓冲液(20 mMol/L NaCl)中透析除盐.( 6)离心去沉淀.( 7)溶液稀释( 1:100 或更高倍稀释)后,于 280nm 测蛋白含量,估计蛋白质 含量1A 280unit=0.8mg 蛋白质一般每 ml 腹水中,含有总蛋白约 25mg36mg.(8)过DEAE 纤维素柱：纤维素柱高 40cm,以20mMol/L NaCl Tris缓冲液 平衡.透析样品以 Tris 缓冲液等量稀释.样品进入柱床速度为 1ml2ml/min ,以 NaCl 线形梯度洗脱.大局部单克隆 IgG 于 40 mMol/L 和 80mMol/L Na

18、Cl 洗脱,也有极少例外的单克隆抗体于 120 mM ol/L 150 mMol/L NaCl 洗脱.测 OD280nm 收集蛋白峰,单克隆 IgG 保存备用 杂交瘤产生各种免疫球蛋白, 但主要是 IgG 和 IgM ,究竟是哪种为主, 那么决定于 抗原的免疫程序.免疫一次,且 3天后就取脾,多为产生IgM的B淋巴细胞. 免疫屡次的多为 IgG.单克隆抗体的鉴定1杂交瘤细胞染色体的检查 采用秋水仙素裂解法进行.2单克隆抗体的类型、 亚型的测定： 购置兔抗小鼠 Ig 类型和亚型的标准抗血清, 采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型.3单抗的特异性鉴定 可以采用各种方法, 如免疫

19、荧光法、 ELISA 法、间接血凝 和免疫印迹技术等,同时还需做免疫阻断试验等.4单抗的效价测定 可采用凝集反响、 ELISA 或放射免疫测定. 不同的测定方法 效价不同. 培养上清液的效价远不如腹水的效价. 采用凝集反响, 腹水效价可达 5X104.而采用ELISA检查,腹水效价可达1.0X106.单抗的效价以培养上清 和腹水的稀释度表示.5必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的水平测定.动物的选择 目前应用最广的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好.就品系而言以 Balb/c 小 白鼠应用最广,由于所有的小白鼠骨髓瘤系均从 Balb/c 小白鼠系诱导出来. Bal b/c 系小白鼠必须用

20、纯系的,雌雄均可,以 812周龄为宜.大白鼠也可, 能产生较多量的单克隆抗体. 现在已经在小鼠杂交瘤的根底上, 发 展了小鼠大鼠,小鼠人以及人人杂交瘤技术.免疫一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原.免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之 一.正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的 B 淋巴细胞,一只纯种小白鼠估 计能产生1.0 x 1075.0X 107种不同的抗体.因此一只正常的小白鼠的脾细胞与 小鼠骨髓瘤融合, 只能有千万分之一的时机获得某一种特定抗体. 所以为了提升 得到某种杂交瘤的时机,必须增强免疫,使产生特异性抗体的 B 淋巴细胞大量 增加.

21、B 淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响. 有人认为处在 转化时期的 B 淋巴细胞可能更易于融合,而免疫以后 78天,虽然是抗体产生 的顶峰时期, 但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少. 故一般认为增强免疫 后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合.1 可溶性抗原蛋白质 以1mg/ml5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂 乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为 0.3ml0.6ml,间隔35周再同样注射一 次,10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验.一个 月后可以经静脉尾静脉给予无佐剂抗原 0.2ml0.4ml,34天后,杀死小 鼠取脾做融合用.2 .颗粒性抗原 如抗原

22、来源方便,可以不加佐剂而增加免疫次数,缩短间隔时间 例如用羊红血球免疫小白鼠,以1%浓度每只皮下注射0 .2 ml,每周2次,共 免疫58次,取脾前3天,再免疫一次即可.有人认为最后一次免疫剂量要大, 大到近于免疫耐受的程度更好.单克隆抗体技术：细胞的选择 脾细胞1材料(1) 免疫过的血清抗体滴度高的 Balb/c 鼠.(2) 1640 培养液2.5% FCS 1640营养液2操作方法 拉颈或用CO2处死小白鼠.(2) 将小鼠放于 70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾.把脾放入5ml含有2.5% FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球.(4) 用镊子轻轻挤压脾,做成

23、脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中.(5) 直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中. 以2.5%FCS1640充满离心管,并以400g离心7min10min (与此同时应 开始制备骨髓细胞).(7) 把沉淀用约 10ml 的新鲜培养液再悬浮.(8) 重复、步骤.(9) 计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于 80%为合格.骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白, 这样的瘤细胞融合后, 可能影响或 降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细 胞.选择骨髓瘤细胞的条件：该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,

24、 以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生丫球蛋 白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;生长速度快,繁殖时间短.目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有： S194/5XXO BU 1;SP2 / 0 Ag14 简称 SP2; P2 X ? Ag8 6 5 3 简称 653; FO以653最为常用,它是由矿物油4甲基一15烷Pristane,降植烷诱发出来 的一种浆细胞瘤Minerol Oil plasmacy toma,MOPC并经过培育形成一株 8- 氮鸟嘌呤有反抗力的亚系.骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-1

25、95 T液氮罐中,试验时复苏、增 殖、传代即可.由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态, 很容易脱落, 因此不需要胰酶处理. 为了预防出 现返祖现象,在融合前,可将培养基内参加 15卩g/ml 8 氮鸟嘌呤.取约1X10 76X 107对数生长期即培养15h20h的骨髓瘤细胞,在室温离心400g 10min,沉淀以2.5% FCS1640液再悬浮并计数.饲养细胞在体外的细胞培养中, 单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖, 必须参加其它 活的细胞才能使其生长繁殖,参加的细胞称之为饲养细胞 Feeder cell.在细 胞融合和单克隆的选择过程中, 就是在少量的或单个细胞的根底上使其生长繁殖 成群体,因此在这

26、一过程中必须使用饲养细胞. 许多种类的动物细胞都可以做饲 养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞, 其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞. 应用腹腔渗出细胞的好处是： 一方面做饲养细 胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片, 为融合细胞的生长造成 良好的环境. 腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠. 也可以是其他种类的 小鼠,如 C57 鼠,昆明小白鼠等.1材料(1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)假设干只.( 2) 11.6蔗糖溶液(经 10 磅 30min 高压灭菌).2操作方法( 1)拉颈处死小鼠.( 2) 70酒精浸泡消毒 1 0min .( 3)用

27、手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔.( 4)用注射器将 4ml 11.6蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉 1min 仍用该注射 器回抽腹腔液体,参加离心管.( 5) 1 000r min 离心 10min.( 6)取上清,以 HAT 选择培养液将细胞制成悬液.台盼蓝染色计数活细胞,使 每毫升含 40 万个活细胞.(7)以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔 0.05ml,含2万个细胞,放入C O2 培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用.如果在融合后发现在培养孔中 饲养细胞数量少,那么可以在细胞换液时再参加一些.单克隆抗体技术：抗体检测 用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的

28、杂交株是很重要的. 检测 抗体的方法很多, 从沉淀反响到放射免疫测定. 由于细胞培养液中的抗体浓度通 常是很低的, 而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反响. 杂交 瘤产生的抗体那么是单克隆的, 所以并不是每项方法都能适用. 一定要选择敏感的、 快速的、一次又能检测多份样品的方法.常用的检测方法如下：1试管溶血反响检测法(1) 材料：杂交瘤细胞,换液后至少两天才收取培养液；绵羊红血球,洗 涤三次后,配成1%悬液；豚鼠补体,无菌采取补体,以pH7.2PBS稀释成20% 溶液,分装小瓶,于-40 C保存.使用时以补体和压积红血球 5:1 (V/V )的量 进行吸收,4C30min,然后

29、2 000r/min离心10min,去红血球,取上清液备用；0.01Mol/L pH7.2PBS液.(2) 操作方法：在小试管中,参加0.1ml杂交瘤细胞用过的培养液,再参加0. 1ml pH7.2的PBS液,然后倍比稀释至一定的稀释度；参加 0.1ml补体和1% 绵羊红血球0.1ml,混匀后置37E水浴1h；观察结果,以绵羊红血球完全溶解 的杂交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价.2斑点检测法 抗红血球外表的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合, 进而 结合补体,而发生溶血斑点,对着光源用肉眼即可判定.(1) 材料：绵羊红血球,处理同试管法,最后配成25%红血球悬液；新鲜豚鼠血清(同

30、试管法处理)；琼脂糖,配成 0.6%PBS液,水浴中溶化；0.01Mol/L pH7.2PBS液；兔抗羊红血球抗体.(2) 操作方法：将溶化的0.6%琼脂糖倒入一试管中,置45C48C水浴中； 加 0.1ml 25红血球悬液, 0.1ml 豚鼠补体, 迅速混匀, 倾注一干净载玻片上； 凝固后,在凝胶外表固定区域滴加 2ml 待测样品, 标准阳性血清和对照试液； 待溶液全部渗入凝胶后,置湿盘；37C温育1h2h,观察并判定结果.强阳性( ) 中等阳性( )弱阳性()阴性(-)必要时可置室温过夜,再判定一次.3膜荧光检测法(1) 材料：培养液HEM或RPMI - 1640;荧光试剂：异硫氰酸荧光素

31、(FI TC)标记的抗小鼠免疫球蛋白；50%甘油缓冲液：1份甘油加1份体积0.05 Mol/L pH 7.2 PBS液混合即成；荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等.(2) 操作方法：用培养液洗涤二次细胞,悬浮成2.0X107/ml :50 pl细胞 悬液加50 p l培养上清液混合,置4C30min,用培养液洗涤3次,1 000r/min 离心；以50PFITC 抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞,水浴30min60m in :用冷培养液洗3次细胞,重新悬浮；取一滴细胞悬液滴在玻片上,复盖 片,用甘油缓冲液封固,置荧光显微镜下观察.着色细胞也可以在固定后观察, 一滴细胞悬液,涂片、风干,用 95

32、%酒精固定10min,固定后的载玻片用PBS 洗涤,盖上盖玻片,进行观察.4免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测 以琼脂双扩散试验法进行, 此法简单易操作, 特异性好.注意必须将培养液浓缩 1050倍,否那么做双向琼扩不出现沉淀线. 其检测方法为：(1)制备各种兔抗小鼠lgG14、 lgM12、lgA12和K、入抗血清,也可直接 购置.( 2)取 5ml 培养物的上清液缓慢参加 0.5ml 的饱和硫酸铵溶液, 混匀,静置 3h, 离心沉淀,去上清,沉淀加 0.05ml 蒸馏水溶解.(3) 制成1 %琼脂糖凝胶板,打孔.中间孔加 20卩l浓缩上清液,周围孔加20卩I特异性抗血清,以10卩l正常小鼠血清作

33、对照.也可以采用酶联免疫吸附试验、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测.单克隆抗体的制备杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养, 收集上清液而获得大量的单一的克隆化 抗体.不过体外培养法得到的单克隆抗体有限, 其不能超过特定的细胞浓度, 且 每天要换培养液. 而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制. 杂交瘤细胞具有从 亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性. 如接种到组织相容性的同系小鼠或不 能排斥杂交瘤的小鼠(无胸腺的裸鼠),杂交瘤细胞就开始无限地繁殖,直至宿 主死亡.产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆 抗体,这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的 10

34、01 000倍.利用免疫抑制剂,如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等,可以加速和促进肿 瘤的生长.1 材料1 )经高压灭菌的降植烷.2Balb/c 鼠：58 周龄.3杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞.4RPMI1640 培养液5新生牛血清2操作方法于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,注射后19周内种植细胞.2收取对数生长期的杂交瘤细胞,用5% FCS1640液洗涤一次,1 000r /min 离心 10min. 取样,用台盼兰染色,计活细胞数,重新用5% FCS1640液配成1.0 X 107 细胞/ml的悬液.4给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞,每只腹腔注射1ml 含1.0X 107个细胞/m

35、l .5接种后 10天左右时间肿瘤体积最大,此时可由腹腔抽取腹水,每隔 13天 取 1 次,可取 10 次.血清可由腋下动脉或心脏采血后别离.单克隆抗体的提纯1 材料(1) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 缓冲液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 缓冲液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 缓冲液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE 纤维素柱2操作方法(1) 小鼠腹水用冷PBS液稀释

36、4倍后,于1.00X105转离心30min,去沉淀.(2) 在4C于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使溶液最终为50% 硫酸铵浓度.(3) 此溶液置冰中30min60min,然后5 000r/min离心10min,去上清.(4) 将沉淀溶于Tris HCI缓冲液(40mMol/L NaCI)中(溶液可能混浊).(5)装入透析袋于Tris HCI缓冲液(20 mMol/L NaCI)中透析除盐( 6)离心去沉淀.( 7)溶液稀释( 1:100 或更高倍稀释)后,于 280nm 测蛋白含量,估计蛋白质 含量1A 280unit=0.8mg 蛋白质一般每 ml 腹水中,含有总蛋白约 25mg36mg.(8)过DEAE 纤维素柱：纤维素柱高 40cm,以20mMoI/L NaCI Tris缓冲液 平衡.透析样品以 Tris 缓冲液等量稀释.样品进入柱床速度为1ml2ml/min,以NaCI线形梯度洗脱.大局部单克隆IgG于 40 mMoI/L 和 80mMoI/L NaC