掌握层析CHROMATOGRAHY的概念ppt课件

1、层层 析析CHROMATOGRAPHY掌握：层析的概念、普通原理掌握：层析的概念、普通原理 凝胶层析的根本原理凝胶层析的根本原理 装层析柱的过程及装柱要求装层析柱的过程及装柱要求熟习：层析技术的分类熟习：层析技术的分类 凝胶层析的特点凝胶层析的特点 凝胶的构造与性质凝胶的构造与性质了解：凝胶的选择了解：凝胶的选择 柱、样品、洗脱液的选择柱、样品、洗脱液的选择 凝胶的保管凝胶的保管 一一.概述概述 层析层析Chromatography(色谱色谱),利用混合利用混合物中各组分的物理化学性质间的差别物中各组分的物理化学性质间的差别(溶解溶解度、分子极性、分子大小、分子外形、吸度、分子极性、分子大小、

2、分子外形、吸附才干、分子亲合力等附才干、分子亲合力等) ，使各组分在支持，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分物上集中分布在不同区域，借此将各组分分别。分别。色谱历史色谱历史古罗马人分析混合染料类似辐射纸色谱古罗马人分析混合染料类似辐射纸色谱1903190319061906年，年，Michael TswettMichael Tswett提出色谱法提出色谱法19311931年，年，KuhnKuhn采用柱色谱分别了类胡萝卜素采用柱色谱分别了类胡萝卜素19411941年，年，MartinMartin和和SyngeSynge提出分配色谱法提出分配色谱法 19441944年，年，Marti

3、nMartin等又提出纸色谱法等又提出纸色谱法 19521952年，年，MartinMartin和和JamesJames发明了气液色谱法发明了气液色谱法19551955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立代色谱分析的建立19561956年，年，StahlStahl系统研讨了薄层色谱法系统研讨了薄层色谱法(TLC)(TLC)19581958年，年，SteinStein和和MooreMoore研制出氨基酸分析仪，研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子构造确定了核糖核酸的分子构造19671967年，年，HorvvathHorvvath和和Hube

4、rHuber等研制了高效液等研制了高效液相色谱相色谱(high-performance liquid (high-performance liquid chromatography,HPLC)chromatography,HPLC)仪仪19751975年，年，SmallSmall等提出离子色谱等提出离子色谱 2020世纪世纪8080年代，超临界色谱年代，超临界色谱2020世纪世纪9090年代，毛细管电泳年代，毛细管电泳18091809年年ReRessss第一次电泳实验第一次电泳实验2121世纪，联用技术、大分子色谱分别、制备世纪，联用技术、大分子色谱分别、制备色谱可望获得更大的开展色谱可望获得

5、更大的开展 层析法进展时有两个相，一个相层析法进展时有两个相，一个相称为固定相称为固定相(Stationary phase )，另一，另一相称为流动相相称为流动相(Mobile phase )。由于各。由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分挪动速度也各异，力影响不同，各组分挪动速度也各异，从而使各组分得到分别。从而使各组分得到分别。二二.层析技术的分类层析技术的分类 1. 按两相所处的形状分类按两相所处的形状分类 以液体作为流动相的层析称为液以液体作为流动相的层析称为液相层析，以气体作为流动相的称为气相层析，以气体作为流动相的称为气相层析。相层

6、析。 其固定相也可有两种形状，一种其固定相也可有两种形状，一种是以固体作为吸附剂的固定相，另一是以固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂布在固体载体外表的液体作种是以涂布在固体载体外表的液体作为固定相。为固定相。层析层析气相层析气相层析gas-chromatography液相层析液相层析liquid-chromatography气气-固层析固层析gas-solid chromatography气气-液层析液层析gas-liquid chromatography液液-固层析固层析liquid-solid chromatography液液-液层析液层析liquid-liquid chromatogr

7、aphy2.按层析过程的机制可分为按层析过程的机制可分为. 吸 附 层 析吸 附 层 析 ( a d s o r p t i o n chromatography ) -利用吸附剂对不同组分吸附利用吸附剂对不同组分吸附 才干的不同加以分别的方法。才干的不同加以分别的方法。.分配层析分配层析(partition chromatography ) -利用不同组分在流动相和固定相利用不同组分在流动相和固定相中的中的 分配系数不同而进展分别的方法。分配系数不同而进展分别的方法。.离子交换层析离子交换层析ion-exchange chromatography -利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和利用离

8、子交换剂与各组分之间的离子亲和 力不同而进展层析分别的方法。力不同而进展层析分别的方法。.凝胶层析凝胶层析gel chromatography -利用不同组分之间分子大小不同，在经过利用不同组分之间分子大小不同，在经过凝胶介质时所遭到的阻滞作用的差别而进凝胶介质时所遭到的阻滞作用的差别而进展分别的方法。展分别的方法。.亲和层析亲和层析affinity chromatography-利用生物大分子之间特有亲和力的不同进利用生物大分子之间特有亲和力的不同进分别纯化的方法。分别纯化的方法。3.按操作技术方式分类按操作技术方式分类.柱层析柱层析colum chromatography -将固定相装在层

9、析柱中，使样品将固定相装在层析柱中，使样品 朝着一个方向挪动，经过各组分随流动朝着一个方向挪动，经过各组分随流动相流动而得到分别的方法。相流动而得到分别的方法。纸层析纸层析paper chrmatography -用纸作为液体的载体，样品点在用纸作为液体的载体，样品点在 纸上随后展开到达分别鉴定的纸上随后展开到达分别鉴定的 方法。方法。.薄层层析薄层层析thin layper chromatography -将适当的吸附剂在玻璃板或将适当的吸附剂在玻璃板或 其他资料薄板上铺成薄层，样品其他资料薄板上铺成薄层，样品 点在上面随后用流动相展开达点在上面随后用流动相展开达 到分别鉴定的方法。到分别鉴

10、定的方法。三三.层析的普通原理层析的普通原理 1.分配系数分配系数(Partition chromatography) 混合物在层析过程中不论层混合物在层析过程中不论层析技术采用哪两种形状的相析技术采用哪两种形状的相(流动流动相和固定相相和固定相)都能到达分配平衡，都能到达分配平衡，用来表达一种物质在两种特定相中用来表达一种物质在两种特定相中的分配程度是用分配系数表示的。的分配程度是用分配系数表示的。 分配系数分配系数-是一种物质在两种特定相中分配，是一种物质在两种特定相中分配，在特定的温度时这个系数的值是一个常数，在特定的温度时这个系数的值是一个常数，即即: 溶质在固定相中的浓度溶质在固定相

11、中的浓度 Cs K= = 溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 Cm有效分配系数：定义为化合物在一个相的总量有效分配系数：定义为化合物在一个相的总量除以另一个相中的总量。实践上是分配系数乘除以另一个相中的总量。实践上是分配系数乘以两个相的体积比。以两个相的体积比。 在不同的层析机制中在不同的层析机制中,分配系数分配系数K的含义的含义不同不同,在吸附层析中在吸附层析中,K为吸附平衡常数为吸附平衡常数;在分配在分配层析中层析中,K为分配系数为分配系数;在离子交换层析中在离子交换层析中K为为交换常数交换常数. 分配系数K值大,阐明物质在层析中被固定相吸附得比较结实,随流动相迁移的速度较慢,留在固

12、定相中的时间较长,在洗脱液中后出峰。假设分配系数K值小，那么该物质在洗脱液中较早出峰。 从一个混合物中分别和纯化一种生物从一个混合物中分别和纯化一种生物物质的纯度如何，取决于混合物中各组分物质的纯度如何，取决于混合物中各组分K 值的差别程度。值的差别程度。 混合物中各组分假设混合物中各组分假设 K值相差较大值相差较大, 那那么能较易地把混合物中的生物物质分别。么能较易地把混合物中的生物物质分别。反之反之,K值相差较小值相差较小,不易把混合物中的生物不易把混合物中的生物物质分别。物质分别。2.讨论层析中的挪动情况讨论层析中的挪动情况 通常采用平衡过程的研讨方通常采用平衡过程的研讨方法法,把层析柱

13、划分为假设干延续部把层析柱划分为假设干延续部分分,每个体系都到达平衡。每个体系都到达平衡。实际板数实际板数(n)：在层析柱上，溶剂延：在层析柱上，溶剂延续不断参与，化合物在流动相和固续不断参与，化合物在流动相和固定相中不断分配平衡，所发生的平定相中不断分配平衡，所发生的平衡次数称为实际板数。衡次数称为实际板数。 凝胶层析凝胶层析 Gel Chromatography一、定义一、定义 凝胶层析凝胶层析是按照被分别物质分子大是按照被分别物质分子大小小,经过具有一定孔径的多孔物质进展分别经过具有一定孔径的多孔物质进展分别的一种方法。其又称为凝胶过滤或分子筛的一种方法。其又称为凝胶过滤或分子筛过滤或排

14、阻层析。过滤或排阻层析。 主要机理是分子筛效应主要机理是分子筛效应,当被分别物质当被分别物质流经凝胶柱时流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同因各组份的分子大小不同,在在凝胶遭到的阻滞作用有差别凝胶遭到的阻滞作用有差别,从而呵斥各组从而呵斥各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分别。分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分别。二二.根本原理根本原理 流动相洗脱液流动相洗脱液固定相凝胶固定相凝胶 原理：被分别物质中各组分的分子量原理：被分别物质中各组分的分子量不同不同 。 进入具有一定孔径的凝胶柱后进入具有一定孔径的凝胶柱后,较大的较大的分子不能进入凝胶孔隙中分子不能进入凝胶孔隙中,被排阻在外被排阻在外,而较

15、而较小的分子那么能进入凝胶孔隙小的分子那么能进入凝胶孔隙,参与洗脱剂参与洗脱剂后后,大分子就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来大分子就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来,遭到的阻力小遭到的阻力小,其流速较快其流速较快,小分子物质从上小分子物质从上一层凝胶孔隙中出来又分散到下一层凝胶一层凝胶孔隙中出来又分散到下一层凝胶孔隙中孔隙中,这样多次反复这样多次反复,大分子物质先从柱中大分子物质先从柱中流出流出,小分子物质后流出小分子物质后流出 。 小分子由于分散作用进入凝胶颗粒内小分子由于分散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留部而被滞留,大分子被排阻在凝胶颗粒外面大分子被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒之间迅速经过。在颗粒之间迅速

16、经过。凝胶层析过程的数理关系凝胶层析过程的数理关系 柱床体积柱床体积(VT) 即凝胶体积以及颗粒即凝胶体积以及颗粒 内外间隙体积的总和。内外间隙体积的总和。VT = 1/4 D2h D是内壁的直径是内壁的直径h是凝胶层析柱床的高度。是凝胶层析柱床的高度。洗脱体积洗脱体积Ve即欲分别物质经过层析即欲分别物质经过层析 柱洗脱下来所需洗脱液柱洗脱下来所需洗脱液 的总体积。的总体积。外水体积外水体积V0即存在于柱床内凝胶外即存在于柱床内凝胶外 面空隙之间的水相体积，面空隙之间的水相体积， 相应于普通层析法中流相应于普通层析法中流 动相的体积。动相的体积。内水体积内水体积即凝胶颗粒内部所含即凝胶颗粒内部

17、所含 水相的体积，它可从水相的体积，它可从 干凝胶颗粒分量和吸干凝胶颗粒分量和吸 水分量求得。水分量求得。凝胶干体积凝胶干体积+ 洗脱体积与及之间的关系洗脱体积与及之间的关系 为样品组分的分配系数，也可以说为样品组分的分配系数，也可以说 是分子量不同的溶质在凝胶内部和是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。外部的分配系数。它只与被分别物质分子的大小和凝胶颗粒它只与被分别物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数与柱无关，也就是说它对每一物质为常数与柱的物理条件无关。的物理条件无关。可经过实验求得。可经过

18、实验求得。 Ve为实践测得洗脱体积。为实践测得洗脱体积。 Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液最好有颜色以便于察看如最好有颜色以便于察看如Hb、印度黑墨水、印度黑墨水经过实践丈量求出经过实践丈量求出.Vi可由可由gWr求得求得g为干为干凝胶重凝胶重,单位为克单位为克,Wr为凝胶的吸水量以为凝胶的吸水量以ml/g表示。表示。 Ve - Vo Kd = Vi 1Kd = 0时时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻意味着该分子完全被排阻于凝胶颗粒之外于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里全部分布于流动相里,在固定相在固定相分布为分布为0,而最先流出。而最先流出。

19、2当当Kd = 1时时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全意味着该分子完全不被排阻不被排阻,可以自在地分散进入凝胶颗粒内部可以自在地分散进入凝胶颗粒内部,它它能均等地分布在流动相和固定相里能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的在两相分配的比值为比值为1,而最后流出而最后流出. 3当当0 Kd 1景象阐明凝胶对组分有吸附作用景象阐明凝胶对组分有吸附作用,此时此时VeVo + Vi,例如一些芳香族化合物的例如一些芳香族化合物的洗脱体积远远超出实际计算的最大值洗脱体积远远超出实际计算的最大值,这些这些化合物的化合物的Kd 1如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸。因此分

20、子的正常因此分子的正常Kd值值01之间之间,这种由小到这种由小到大的大的Kd值顺序决议了物质流出的顺序。值顺序决议了物质流出的顺序。Ve与与MW的关系的关系 对同一类型的化合物对同一类型的化合物,洗脱特性与组分洗脱特性与组分的分子量有关的分子量有关,流过凝胶柱时流过凝胶柱时,按分子量按分子量(MW)大小顺序流出大小顺序流出,MW大的走在前面大的走在前面,Ve与与MW的关系可用下式表示的关系可用下式表示: Ve = K1 - K2lgMW K1 K2 为常数为常数, MW为分子量为分子量三三.凝胶层析的特点凝胶层析的特点 一优点一优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结凝胶是一种不带电荷的惰

21、性载体。其结 构稳定构稳定,所以凝胶本身不与样品发生化所以凝胶本身不与样品发生化 学反响。学反响。 2.凝胶层析的操作条件较温暖凝胶层析的操作条件较温暖,不易引起生不易引起生 物物质的变性物物质的变性,即使用来分别一些理化性即使用来分别一些理化性 质不稳定的物质也很少被破坏。质不稳定的物质也很少被破坏。 3.样品得率高样品得率高,反复性好反复性好.假设按比例扩展柱假设按比例扩展柱 的体积和高度的体积和高度,可进展大量样品的分别纯可进展大量样品的分别纯 化。化。二缺陷二缺陷1.要求样品和洗脱液的粘度很低。要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所

22、以可被所以可被 纯化的物质的分子量范围遭到限制。纯化的物质的分子量范围遭到限制。3.凝胶构造对某些溶质分子具有吸附作用凝胶构造对某些溶质分子具有吸附作用,如如 芳香族化合物与脂蛋白等。芳香族化合物与脂蛋白等。 四四.凝胶的构造与性能凝胶的构造与性能 1.葡聚糖凝胶商品名为葡聚糖凝胶商品名为Sephadex 构造：构造： 葡聚糖用交联剂葡聚糖用交联剂1-氯代氯代-2 ,3-环丙烷使葡聚糖环丙烷使葡聚糖之间经过醚键之间经过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联交联 聚合而成的三维空间网状构造。聚合而成的三维空间网状构造。OH 特点：特点： Sephadex 的三维空间网状构造的网孔大小取决

23、于交的三维空间网状构造的网孔大小取决于交联度联度,交联度的大小可在合成交联度的大小可在合成Sephadex 时控制参与时控制参与交联剂的百分比决议交联剂的百分比决议.交联剂的百分比高交联剂的百分比高,交联度大交联度大,网状构造愈严密网状构造愈严密,孔隙愈小孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小吸水后膨胀也愈小,机械机械强度高强度高,分别物质的分子量也小。反之分别物质的分子量也小。反之,交联剂的百交联剂的百分比低分比低,分别物质的分子量大。分别物质的分子量大。G类类Sephadex的型号的型号表示每克干凝胶吸水量表示每克干凝胶吸水量x10,如如G-50表示每克干凝胶表示每克干凝胶吸水量为吸水量为5ml。Se

24、phadex的化学性质稳定的化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱不溶于水、盐、弱酸和碱, 耐热耐碱不耐酸。耐热耐碱不耐酸。2.琼脂糖凝胶商品名为琼脂糖凝胶商品名为Sepharose) 它是一种大孔凝胶它是一种大孔凝胶,其任务范围的下限几乎是其任务范围的下限几乎是 Sephadex的上限的上限,可分别可分别MW40万以上的物万以上的物质质,因此可用来分别核酸及病毒。因此可用来分别核酸及病毒。琼脂糖凝胶不带电荷琼脂糖凝胶不带电荷,不受微生物作用而降解不受微生物作用而降解,但对热不稳定但对热不稳定,易受易受pH影响影响(只在只在pH4.5-9.0范围内稳定范围内稳定.3.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶

25、运用范围及效果同葡聚糖凝胶类似运用范围及效果同葡聚糖凝胶类似,但化学性但化学性质较葡聚糖稳定质较葡聚糖稳定,可在可在pH2-11范围内运用范围内运用.聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶P Bio-Gel P，由美国，由美国Bio-Rod厂消费，型号很厂消费，型号很多，从多，从P-2至至P-300共共10种，种，P 后面的数字再后面的数字再乘乘1000就相当于该凝胶的排阻限制。就相当于该凝胶的排阻限制。 4.凝胶的选择凝胶的选择 选择何种凝胶以及它的型号选择何种凝胶以及它的型号,这需求根这需求根据实验条件据实验条件,溶质的分子量的大小和分别任溶质的分子量的大小和分别任务的目

26、的而定务的目的而定,每种型号凝胶都有一定分别每种型号凝胶都有一定分别溶质分子量的范围溶质分子量的范围,选择的型号凝胶要能满选择的型号凝胶要能满足实验要求。足实验要求。六六.其它条件选择其它条件选择 1.柱的选择柱的选择 层析的长度层析的长度L与直径与直径D之比之比L/D对层析分辨率有影响对层析分辨率有影响,普通对用于组别分别的层析普通对用于组别分别的层析柱其柱其L/D为为1518：1,层析柱的体积普通大于样品层析柱的体积普通大于样品体积的体积的410倍倍,这类常用于脱盐这类常用于脱盐.对于分级分别可对于分级分别可采用采用L/D 40：1,甚至甚至100：1,层析柱体积普通大于层析柱体积普通大于

27、样品体积的样品体积的25倍。倍。 柱短而粗柱短而粗,那么易使样品稀释那么易使样品稀释,柱长而窄柱长而窄,那么柱的那么柱的管壁效应较大管壁效应较大,会呵斥拖尾景象。会呵斥拖尾景象。 2.样品的选择：样品的选择： 量适当量适当, 粘度小。粘度小。 3.洗脱液的选择：洗脱液的选择： 每种样品分别所用的缓冲洗脱液应根据使样每种样品分别所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原那么运用。品稳定的原那么运用。七七.运用运用 1.分别纯化分别纯化 2.脱盐脱盐 3.高分子溶液的浓缩高分子溶液的浓缩 4.测分子量测分子量凝胶层析法分别蛋白质凝胶层析法分别蛋白质 原理原理 血红蛋白血红蛋白HbHb，分子量，分子量64

28、 48064 480左右左右与二硝基苯与二硝基苯鱼精蛋白鱼精蛋白DNPDNP鱼精蛋白，鱼精蛋白，分子量分子量2 00012 0002 00012 000混合物，由于分子混合物，由于分子大小不同，经过大小不同，经过Sephadex G50Sephadex G50层析受阻层析受阻滞程度有差别，从而到达分别。滞程度有差别，从而到达分别。 器材器材 层析柱层析柱1.51.525ml25ml 等等 试剂试剂 1.1.样品液：样品液：DNP-DNP-鱼精蛋白、鱼精蛋白、HbHb2.Sephadex G-50 2.Sephadex G-50 操作操作 1. 1. 装柱：在层析柱的底部出口套上乳胶塑料装柱：在层析柱的底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的占体积的1/31/3时，封锁下端出口，自顶部渐时，封锁下端出口，自顶部渐渐参与已处置好的渐参与已处置好的Sephadex G-50Sephadex G-50悬液，待悬液，待底部凝胶堆积底部凝胶堆积12cm12cm时，再翻开出口，凝胶时，再翻开出口，凝胶加至凝胶堆积离层析柱口约加至凝胶堆积离层析柱口约3cm3cm即可。即可。 装柱留意点：装柱留意点：不得有气泡和分层不得有气泡和分层