Western_blot的原理、操作及注意事项

1、Western b 1 ot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分,并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作 为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分 辨率和固相免疫测定的特异敬感等多种特点,可检测到低至P5ng （最低可到1 0-10 Opg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的选择和制备A：样品的制备1组织：组织的处理方法:组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS,O°C研磨，加入5X STOP bu f f er, 180W, 6mins, 0°C超声波破碎，5 OOOrpm , 5m i n s 离心，取上 清。加入P ME（

2、9 . 5 ml加入0. 5ml）,澳酚蓝（9. 5 m 1加入0. 5ml）煮沸lOmi n,分装后于-20°C保存，用时取出，直接溶解上样。2细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5 XSTOP b uffer,收集，1 8 0 W, 6mins, 0°C超声波破碎，5 00 0 rpm, omi n s 离心,取上清。 加入B M E （9. 5ml加入0. oml）,澳酚蓝（9. 5ml加入0. 5ml）煮沸1 Omin,分 装后于-2 0 °C保存，用时取出，直接溶解上样。3分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入B-ME、澳酚

3、蓝制样。B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1 .双缩服法：双缩服法是第一个用比色法测定蛋口质浓度的方法。在需要快速，但不很准 确的测定中，常用此法。硫鞍不干扰显色，这对蛋口质提纯的早期阶段是非常有 利的。双缩腺法的原理是Cu2 +与蛋口质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫 蓝色络合物,此物在54 0 nm波长处有最大吸收。双缩腺法常用于0. 5 g/ClOg/ L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、G ood缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积1 0%冷的三氯酷酸沉淀蛋 口质，然后弃去上清液，再用已知体积的lm Na OH溶解沉淀的蛋口质进行定量测定。

4、2. Lowr y 法:此法是双缩服法的进一步发展。他的第一步就是双缩腺反应，即Cu卄与蛋 口质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钳磷一磷磚酸试剂（福林- 酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩腺法灵墩得多，适合于测定2 0mg/r 4 00mg/L含量的蛋口质溶液。其干扰物质与双缩服法相同，而且受他们的影响 更大,硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福 林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有 在pH 10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的C u2+-蛋白质溶液中时，必须 立刻搅拌，以使磷钳酸一磷磚酸试剂在未被破坏之前能有

5、效地被Cu2+-蛋口质络 合物所还原。3.紫外吸收法：大多数蛋口质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是山于蛋口质中有酪氨 酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此,利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质 的含量。如果没有干扰物质的存在，在2 80nm处的吸收可用于测定0. 1 0. omg./m 1含量的蛋口质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在2 6 0nm波 长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述 公式粗略讣算：却（）是蛋白质溶液在2 8 Onm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。26（）是蛋白质溶液在2 6 0 nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值

6、。 此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋 白质和其他核酸不一定适用。山于各种蛋口质所含芳香族氨基酸的量不同，因此,0.1%浓度为0. 1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（°28C）在0.52.5之间变化。所有的蛋口质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清口蛋口的a 0.1% 在225nm和215nm处分别为5.0和1 1 .7,而在2 8 0门皿处测为。.58。在23011 m以下的强吸收是山于肽键的存在，因此,此值对所有的蛋口质都是一样的。从 2 I 5nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为1 Onl/ml1 0 Ou 1 / ml的蛋口质。

7、蛋口质浓度可以近似地山下式得到：e宀/ 八« lan Ecm、蛋曰匪浓度mg/L丿=I44（A J八“-丿丄光密度之差求a得，这一 公式是减去溶液中非蛋口质成分产生的误差。但是，蛋口质之间的分子量差异比 较大，因此，在比较儿种蛋口质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收 峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。4 . Bra d ford 比色法：Bradf o rd比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯 乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2疏基乙醇、乙酸、硫酸鞍、Tris和一些 碱性缓冲系统的干扰。分别在两组微量离心管中各加入0. S

8、mg/ml牛血清口蛋白（5, I 0, 15和20P 1 ），以 0. 1 5 mmol/1 N a Cl 补足至 100M,同时以两管 100P 1 的 0. 15mmol/l NaC 1作空口对照。每管各加入lml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置 2分钟offllcm光径的微量比色杯测A 5 9 5,取A595吸光值对标准蛋白浓度作图， 画标准曲线，并测量待测样品的A595o从BS A标准曲线中确定待测样品的浓度。 测定10-100Mg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品 浓度过高，可稀释后进行，或在10- 1 OOPg另作一标准曲线进行测定。5.电泳估算法（我们

9、选择此法）：样品倍比稀释,SD S -PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大 概浓度。以提取癌组织总蛋口为例： 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH20漂洗5I 0次, 再用预冷的I XPBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。 每2克组织加入3ml IXPBS匀浆,保持在4°C条件进行。 加入5XSTOP Buffe r缓冲液lml,混匀，4 °C下超声碎化。再加入0. 5mlBME, 0.5ml漠酚蓝，煮沸1 0 mi n s,至此，制样过程完成； SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。二、S DS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SD

10、S- P AGE）A：实际操作1. 做胶前的准备1）检查是否有足够的、干净的spacer、c omb和架子。2）检查是否有新鲜的，足量1 0 % APS,没有立刻重配。3）按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离 胶各组分的用量。2. 制胶，电泳1）装好架子。2）按照下面配方配制分离胶。（单位:ml , Total： 8ml）7. 5%10%15%2 X Sep. buf f er41430% Gel. sol2.02. 74ddH;O1 .91. 20TEMED8ul8u 18ul10%APS80u 180ul80ul在胶上面加入一层蒸憎水,促进胶更好的凝集。3

11、）待分离胶凝集后，配制浓缩胶。（单位：ml, Total： 3. oml）3%2 X Stack i n g. b uffer1.730% Gel. sol0 . 35ddH：O1.4TEME D5u 110% A PSoOu I倒好后插入预先准备好的梳子。4）待胶凝集好后，上样，电泳。 上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用1 0 0-12 0 V电压。一般电泳时间在1. 5小时左右。B :注意事项及常遇到的问题1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。2）上样蛋白量不应超过30ug/mm（载荷面即：如果你的胶槽是ommXlmm, 则载荷面为：1mm X5m

12、m二5 mm '）。3）gel通常在0. 5-1 h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此 时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统 实际不纯或实效。4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特 别是甘油。5 ）电泳中常出现的一些现象：- 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。-条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有 气泡，或者两边聚合不完全。拖尾:样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。三、转移在电流的

13、作用下，使蛋口质从胶转移至固相载体（膜）上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF （聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有 更好的化学兼容性。有两种规格：Immob订on-P（0. 4 5 um）和Immobi 1 on PSQ （0. 2um for MW <2 0 k Da） <>A半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲 液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比 较严酷，但是其转移时间短，效率高。1实验条件的选择电流lmA-2mA /

14、cm 2 ,我们通常1 0 OmA /膜，按照目的蛋白分子大小、胶 浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间(h)801408%1. 52. 02580101. 515-4 01 20. 7 5<20150.52实验操作(I )滤纸和膜的准备(在电泳结束前2 0分钟应开始准备工作)oA. 检查是否有足够的tran s f er bu f f er,没有立即配制。B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。C. 将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buf f e r中。D. 将合适的徐胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入tra n s f er b

15、 u ffer中。(2)转移A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。B. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些tran s fe r bu f fer到膜上，保持膜的湿润。C. 将胶剥出，去掉stack gel,小心的移到膜上。D. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。倒上些t r ansfer b u ffer,再铺两张 黑胶滤纸。F. 装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。G. 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。Filer Paper/Caiho拒 BuHerSDSPAGE 諮CATHODE (TT ran

16、ufe MerrbneFilter Paper* Anode Bvtref liFillet Paper/ Anode Buffer I靠胶滤纸胶膜靠膜滤纸ANODE (卄Fig. 1：. Semi-dky transfef $KiCk Crt-MFintrfy3注意事项及常遇到的问题1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸 =膜二胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3 ）因为膜的疏水性，膜必须首先在屮醇中完全浸湿。而且在以后的操作中， 膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋口质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨

17、的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。5）转移时间一般为1 . 5小时，（1mA- 2 mA/ c m2, 10% g e 1 ）,可根据分子量 大小调整转移时间和电流大小。B湿法我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。C转移后效果的鉴定1染胶用考马斯亮兰染色经dest a i n脱色后，看胶上是否还有蛋口来反映转移的效果。2.染膜有两类染液选择,可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s r e d、F astgr een FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的 分析用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、i ndia ink、Amido, blac k 10B等， 染色

18、后膜就不能用于进一步的分析。四、封闭（block）封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋口质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有 b ov i ne s e rum album i n（BSA）, non-fat mi 1 k, case i n , g e latin, twe e n 20 等，我们一般用 nonfa t m i 1 k o在转移结束前配好5 %的M订k （TBST溶解）。转移结束后将膜放入m订k中 bl o c k（一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜），并清洗整理好 用过的滤纸，以便下次使用。B I ock 4° C 0/N,或RT 1小时。五、孵

19、育一抗A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。B. 配好5%的Mik （TBST溶解），按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释， 最好采用梯度稀释。C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适'勺延长或缩短时间。注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度 高的抗体作为marker与一抗同时孵育。六、洗涤用TBST先快速洗三次，把mi 1 k尽快的wash掉。然后3m i ns *5。洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景 的深浅。七、孵育二抗孵育RT 1. 5小时。一般采用HRP标记

20、的二抗，稀释比例为l:5000o二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及 根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者 标志其他探针（如核素等）的。八、洗涤用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mi n s *5。洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深 浅，所以洗涤一定要干净。九、显色（HRP酶）1.增强化学发光法（ECL）Ec 1显色原理：氨基苯二酰耕类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常 用的一类化学发光剂。鲁米诺（lumin ol,

21、5'-氨基-2, 3 -二氢-1, 4-酥嗪二酮） 的分子结构及化学反应式如下：HA/OH- fli卜？十H?O 光鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl 底物中，含有H202和鲁米诺，在HRP （辣根过氧化物酶）的作用下,发出荧光来。 试验步骤：1 ）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各lml/m embrane ）o2）将混合物覆盖在膜表面,1-2分钟,摇晃使均匀。3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光Imino5）显影、定影。6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。注意：荧光在一段时间后会

22、越来越弱。2 . DAB显色DAB （3, 3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色 沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化 染色应用特别理想。对于AP标记的二抗我们选用BCIP andNBT显色，它们在碱性磷酸酶（A P）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。十、分析结果及其判断常见问题原因分析及处理方法：见附录一.二。附录一:Tro u b 1 e s ho o ting Bl o t ting Problems(P43 48)附录二：Wes t ern B lot t i ng T r oublesh o oting L ogic

23、 Tree (P390 394)附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液1) 5 x Stop S ol u tion (S amp 1 e buf f er) pH6. 7:Stockj2 0 % G 1 yc e rolt o c k10% SDS2 5 0 mM T r isblue o rt o tai10 0 ml50g or 2 50m 12 0%15. 14g475. 0 0mlto_ u_s ejtake 9 5ml sSDS add BME 0. 5mlbromp h e n o 1onine 4 to t a ste0. 8 b is-acrylami d e0.8g29. 2% aery 1 am i de29 . 2 gt ot a 1100ml3) 2x La emm 1 i Sepa r