lncrna研究策略之rnapulldown试验技术

1、【实验技巧】IncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术IncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术RNA pull-down 是检测RNA吉合蛋白与其靶 RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNApull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物 洗脱后，通过 Western Blot 实验检测特定的 RNA结合蛋白是否与 RNA相互作用。1) lncRNA 筛选：通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行l

2、ncRNA表达谱分析；通过生物信息 学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA,构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因;通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。2) lncRNA 确定：通过5' RACE获取lncRNA 5'全长，3' RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序歹限3)表达分析：细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。4)功能研究：功能获得性研究：构建lncRNA

3、过表达载体：原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现 lncRNA的过表达。然而有些 lncRNA很大或全长尚未分离,这时将视 lncRNA在基因组上的定位 采取不同的研究策略。功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA反义核酸等方法沉默lncRNA,干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响；采用 RNA pull down 、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNAPurification)等方法检测

4、与 lncRNA 结合的 DNA RNA蛋白质。采用lncRNA芯片分析技术结合 mRNA寸lncRNA功能进行预测，研究lncRNA trans和cis作用机 制。采用配体指数级富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment , SELEX),设计一种RNA1已体，与癌症相关的lincRNA结合达到抑制肿瘤细胞的生长 和转移。采用快速预测 RNA与蛋白质相互作用与结构域(catRAPID)在线算法来预测 RNA与蛋白质的相互作用，该算法根据RNAm蛋白质的二级结构、氢键和分子作用力来评估它们之间的相互作用的倾

5、 向。采用非编码 RNA沉默和定位分析(c-KLAN)技术对IncRNA进行功能缺失(Loss-of-function ) 研究和细胞定位，该技术是在基于核糖核酸内切酶制备的小干扰RNA(esiRNA)和荧光原位杂交(FISH) 2种现有的研究方法的基础上建立起来的。5)表达调控：将lncRNA表达与其他领域相结合，解释 lncRNA调控机理。DNA甲基化：可通过检测相应基因甲基化差异与lncRNA结合分析。转录因子： 研究lncRNA与转录因子的调控机制。染色质重塑：lncRNA表观调控。一.质粒转化、涂板、摇菌1 .取JM109感受态细菌80”,加入管中，用 10al枪头沾取质粒加入上述E

6、P管中，混匀。2 .冰上静置 30min。3 .42 C 热休克 90-120s。4 .迅速移至冰上静置 2min。5 .在超净台内，于上述EP管中加入50alLB培养基(Amp-) , 37C, 160rpm摇床，增菌。6 .菌液4,000rpm离心10min,弃大部分上清，将沉淀重悬，菌液全部加入LB平板(Amp+)上，涂布均匀，37 c倒置培养(过夜 12-15h)。7 .将37c培养(12-16h )平板取出，于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5mlLB培养基(Amp+的15ml离心管中，于 37C、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒 中提。2 .质粒中提

7、(TIANGEN DP107-02)1 .柱平衡：向吸附柱 CP3中(吸附柱放入收集管中)加入 500al的平衡液BL, 12,000rpm离心 1min,尽量吸除上清。2 .取过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min,尽量吸除上清。3 .向留有菌体沉淀的离心管中加入250al溶7P1使用移液器彻底细菌沉淀。4 .向离心管中加入 250 al溶液P2,温和的上下翻转 6-8次使菌体充分裂解。5 .向离心管中加入 350 al溶液P3,立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm ,离心10min,此时在离心管底部形成沉

8、淀。6 .将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm ,离心30-60sec ,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7 .向吸附柱 CP3中加入500al去蛋白液 PD, 12,000rpm离心，离心30-60sec ,倒掉收集管中的 废液，将吸附柱 CP3重新放回收集管中。8 .向吸附柱 CP3中加入600al去蛋白液 PW 12,000rpm离心，离心30-60sec ,倒掉收集管中的 废液，将吸附柱 CP3重新放回收集管中。重复一次。9 .将吸附柱CP3重新放回收集管中， 12000rpm离心2min。10 .将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向

9、吸附膜的中间部位滴加50al洗脱缓冲液EB,室温放置2min , 12,000rpm离心2min ,将质粒溶液收集到离心管中，放冰盒，测浓度。3 .质粒线性化：本实验使用的酶为 Biolabs的重组酶Kpn I。酶切后进行跑胶。4 .琼脂糖凝胶电泳1.配胶。成分：琼脂糖粉、TBE、I H2O,少量EB与H2O混合加入放好琼脂糖粉的锥形瓶中，摇匀，放入微波炉加热1-2min。3 .滴加少量EB,于锥形瓶中摇匀。4 .倒入胶板中，插入梳子，待琼脂糖凝固。5 .小心拔掉梳子，取 10 al样品加入1心1的10XLoadingBuffer 缓缓加入点样孔，并在最右边 的点样孔加5心lDNAmakeb6

10、 .接通电源。7 .电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，于紫外灯下切下目的条带。5 .胶回UT ( TIANGEN DP214-02)1 .向吸附柱CB2中加入500al平衡液BL, 12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附 柱重新放回收集管中。2 .将单一的目的 DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。3 .向胶块中加入等倍体积溶液PC, 50c水浴放置10min左右，其间不断的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。4 .将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。5 .向吸附

11、柱CB2中加入600al漂洗液PVy 12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附 柱CB2放入收集管中。6 .重复操作步骤。7 .将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min ,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置 数分钟，彻底晾干。8 .将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB,室温放置 2min, 12,000rpm 离心2min,收集 DN砥液。6 .转录以及生物素标记：1 .取无RNA酶管，按下表操作：2 .取出孵育好的 EP管，加入2al的DNasel, 37c孵育15min以除去体系中的 DNA3 .取出上述操

12、作的 EP管，加入2 a ( pH=)终止反应。4 .取1agBiotin 标记的RNA加入适量StructureBuffer, 使得RNA成二级结构。然后将RNA95c 加热2min ,冰浴3min ,室温静置 30min。5 .磁珠准备：使用 RIPWashBuffer500 al 冲洗磁珠 3次。6 .用50心lRIPWashBuffer 重悬磁珠，然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中，4 c过夜。7 .过夜的混合物 3000rpm离心1min ,去上清。冲洗3次，切记将液体沿壁加入或者滴加，上下缓慢翻转混匀，切勿用移液器吹打。9 .往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液，裂解液中加入

13、适量RNase抑制剂，室温放置 1h。RIPWashBuffer 冲洗 3 次，1 次10 .将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心，上清回收，使用1ml。11 .于样品中加 5XSDS上样缓冲液，95c变性10min,跑SDS-PAGE!胶。12 .考染：取出SDS-PAGE!胶于考马斯亮蓝染色液中，摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色12h,中间更换几次脱色液至条带清晰，背景低为止。13 .将目的条带切下送测序 （质谱检测）。问题1: RNA降解可能原因：1）无核酸酶的环境被破坏2）体外转录的 RNA探针降解解决办法：1）清洗和使用新开的离心管和试剂等2） RNA针合成后，电泳检测其长度和浓度问题2: RNA结合蛋白的亲和力不够：可能原因：1）结合缓冲环境没有优化2）裂解不完全3）磁珠用量不足4） RNA探针用量不足解决办法：1）优化孵育时间、温度、盐浓度等条件2）增加裂解液和蛋白上样量的比例3）增加裂解液4）增加磁珠用量5）增加探针用量6）确定生物素和链霉亲和素效率问题3: RNA结合蛋白没有结合可能原因：1）靶蛋白量不足2）缓冲体系不对3） RNA探针和蛋白的亲和力本来就低解决办法：1）增加上样蛋白量2）应用低盐体系3）加入交联试剂问题4:结合的非特