诺如病毒试验室检测

1、诺如病蠹实验室检测诺瓦克病(Norwalk Viruses , NV 是人类杯状病蠹科(HumanCalicivirus , HuCV 冲诺如病蠹(Norovirus,NV )届的原型代表株。NV 是一组形态相似、抗原 性略有不同的病蠹颗粒。诺瓦克病蠹最早是从1968 年在美国诺瓦克市爆发的一次急性腹泻的患者粪便中别离的病原。2002 年 8月第八届国际病蠹命名委员会 批准名称为诺如病蠹(Norovirus,NV )。诺如病蠹与在日本发现的札幌样病蠹 (Sapporo-likeVirus , SLV，正式名称为札如病蠹(Sapovirus,SV),合称为人 类杯状病蠹。诺如病蠹感染性腹泻在全世

2、界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。诺如病蠹抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造 成反复感染。诺如病蠹感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、 物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处 引起集体爆发。诺如病蠹有许多共同特征：直径约为2635nm 无包膜，外表粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中别离，不能在细胞或 组织中培养，也没有适宜的动物模型；基因组为单股正链RNA 在氯化饨密度梯度中的浮力密度为 1.361.41g/cm3;电镜下缺乏显著的形态学特征， 负染色电 镜

3、照片显示，NV 是具有典型的羽状外缘，外表有凹痕的小圆状结构病蠹。诺如病蠹根据遗传性分为 5 个基因组，至少有 29 个基因群，其中基因组 I (GGD有 8 个基因群，基因组 II (GGII)有 17 个基因群，基因组 III (GGIII) 有 2 个基因群，基因组 IV (GGIV 和基因组 V (GGV 各有 1 个基因群。与人类 有关的主要是 GGk GGII和 GGIU 一、标本米集考前须知：粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(4872h),此时为稀、软便，病蠹排出量最多。一次流行，至少采集10 例患者粪便，每份标本量约 15ml，成形便和肛拭子诊断意义很小。标本置

4、 4C 可存放 23 周，运送也 要低温条件。病人呕吐物是粪便标本的最正确补充，有助于病原的诊断。该标本的采集、储存和运送条件同于粪便。从流行病学角度出发，在水、食物或其它外环 境标本中检出 NV意义重要。需注意检测技术要锁定在高度疑心的传播媒介上， 尽早采样并置 4C 存放，假设是饮用水，需用大容量(5100L)浓集病蠹后检测。二、实验室检测：1、 电镜检查：电镜法分直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM) , EM法观察的灵敏 度较低，要求每毫升粪便样品中至少有大约106个病蠹粒子，因此只能用于 患病早期病蠹大量排出时采集的样本检测。IEM法比 EM法的敏感性可提高 100倍，主要应用患者

5、恢复期血活捕捉同型抗原，从而增加检出率。电镜法的缺陷在于设备昂贵，不能广泛普及；检测结果与操作者的技能和经验有直 接关系；灵敏度相对较低；不适于大规模流行病学调查。2、免疫法：免疫法包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-AvidinImmunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。RIA法的灵敏度比 IEM法可提高 10100 倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA 法的缺乏之处在于它需要 6d ,且需要放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与 RIA 法相 当，该方法已成为美国疾病预防控

6、制中心检测 NLV抗原和抗体的标准实验方 法之一。1992年 Jiang 等重组杆状病蠹表达 N 保壳蛋白成功后，建立起的 NV 酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其缺乏之处是免疫反响的株型特异性 太强，所以应用范围还比拟窄。酶链免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速， 且较经济，是可广泛应用的检测方法。3、分子生物学检测：分子生物学检测方法杂交技术和逆转录聚合酶链反响(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的NV尤其是低浓度的 NV感染夕卜，最大的优点在于可以进一步对病蠹进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。等温核酸扩增法 (NASBA百接扩增 R

7、NA 来检测 NV,样品中病原 RNAft 到指数级扩增，产物通 过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。该方法的灵敏度略低于 RT-PCR 法；整个过程只有一步 RN/F增，防止了 RT-PCF在的 RN位义污染；缩短 了操作时间；假阳性率低。RT-PCR 佥测食物中 NV 存在样品病蠹量含量低， 样品量大且成分复杂等问题，因此病蠹富集浓缩、样品处理是检测的关键，其中有两个重要方面影响检测结果，一是样品中病蠹浓缩后的回收率，二是 抽提核酸的完整程度和纯度。病蠹浓缩病蠹浓缩NV浓缩方法一般分为两大类，一类为有机絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇(PEG沉淀,PEG是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作

8、用的高分子聚合物，先改变样品pH值，使蠹粒与样品微粒分开，PEG 把病蠹沉淀下来，到达浓缩的目的。目前对于固 体样品 PEG 沉淀法是最有效的浓缩方法。膜过滤法是另一类有效浓缩病蠹的 方法，通过改变膜的 pH 值使之与带有电荷的蠹粒结合捕捉病蠹， 这种方法通 常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。检测海水、生 活污水中的 NV 曾用过这种方法，为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。核酸提取食品样品成分复杂， 所含有的脂肪、 蛋白质、 金届离子等物质都是 RT-PCR反响抑制因子。NV 是单链 RNA 病蠹，核酸提取方法的优劣取决于两 个方面：核酸的质量和去除抑制因子的能力。应用较成熟广泛的是月瓜法RNA提取法，即异硫割酸月瓜-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，该方法改良后制成 市售的 TRIzol、RNAz