引物设计保护碱基列表

1、在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的 Tm值和各引物的碱基分布及 GC含量。如果某条引物 Tm值偏小， GC%较低，添加时多加 G或

2、C，反之亦反。保护碱基列表EnzymeOligo SequenceChain% CleavageLength2 hr20 hrGGTCGAC C800AccICGGTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200CACATGT G800AflIIICC ACATGT GG10>90>90CCC ACATGT GGG12>90>90GGCGCGCC8>90>90AscIAGGCGCGCC T10>90>90TTGGCGCGCC AA12>90>90CCCCGGG G850>90AvaICCCCCGGG GG10>

3、90>90TCC CCCGGG GGA12>90>90CGGATCC G81025BamHICGGGATCC CG10>90>90CGC GGATCC GCG12>90>90CAGATCT G800BglIIGA AGATCT TC1075>90GGA AGATCT TCC1225>90GGCGCGC C800BssHIIAG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA1250>90BstEIIGGGT(A/T)ACC C9010AACTGCAGAACCAATGCATTGG2200BstXIAAAACTGCAGCCAATG

4、CATTGG AA242550CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT2725>90CATCGAT G800ClaIGATCGAT C800CC ATCGAT GG10>90>90CCC ATCGAT GGG125050GGAATTC C8>90>90EcoRICGGAATTC CG10>90>90CCG GAATTC CGG12>90>90GGGGCC CC8>90>90HaeIIIAGC GGCC GCT10>90>90TTGC GGCC GCAA12>90>90CAAGCTT G80

5、0HindIIICC AAGCTT GG1000CCC AAGCTT GGG121075GGGTACC C800KpnIGGGGTACC CC10>90>90CGG GGTACC CCG12>90>90MluIGACGCGT C800CGACGCGT CG102550NcoICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075CCATATG G800CCCATATG GG1000NdeICGC CATATG GCG1200GGGTTT CATATG AAACCC1800GGAATTC CATATG GAATTCC2075>90GGGAATTC CA

6、TATG GAATTCCC2275>90GGCTAGC C800NheICGGCTAGC CG101025CTA GCTAGC TAG121050TTGCGGCCGC AA1200ATTT GCGGCCGC TTTA161010NotIAAATAT GCGGCCGC TATAAA201010ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT242590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA2825>90NsiITGC ATGCAT GCA1210>90CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT22>90>90TTAATTAA800Pa

7、cIGTTAATTAA C10025CCTTAATTAA GG120>90GTTTAAAC800PmeIGGTTTAAAC C10025GGGTTTAAAC CC12050AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG2475>90GCTGCAG C800TGCA CTGCAG TGCA141010PstIAA CTGCAG AACCAATGCATTGG22>90>90AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA24>90>90CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT2600CCGATCG G800PvuIAT CGATCG AT

8、101025TCG CGATCG CGA12010SacICGAGCTC G81010SacIIGCCGCGG C800TCC CCGCGG GGA1250>90GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800SalIGCGTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075ScaIGAGTACT C81025AAA AGTACT TTT127575CCCGGG6010SmaICCCCGGG G8010CCCCCGGG GG101050TCC CCCGGG GGA12>

9、90>90GACTAGT C810>90SpeIGG ACTAGT CC1010>90CGG ACTAGT CCG12050CTAG ACTAGT CTAG14050GGCATGC C800SphICAT GCATGC ATG12025ACAT GCATGC ATGT141050AAGGCCT T8>90>90StuIGA AGGCCT TC10>90>90AAA AGGCCT TTT12>90>90CTCTAGA G800XbaIGCTCTAGA GC10>90>90TGCTCTAGA GCA1275>90CTAG TCTAGA CTAG1475>