蛋白酶酶活测定方法福林法

1、 蛋白酶酶活的测定方法福林法 1. 酶单位定义：1g 固体酶粉或1mL液体酶，在一定温度和 pH值条件下，1min水解酪 素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以 u /g u/mL表示。 2. 原理 蛋白酶在一定温度和 pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸如酪氨酸、 色氨酸等，在碱性条件下，将福林试剂Folin 复原，生成钳蓝和鸨蓝，用分光光度法测 定，计算其酶活力。 3. 试剂和溶液 3.1福林试剂的准备 于2000mL磨口回流装置中加 入鸨酸钠NaWO2H2。100g,钳酸钠 NaMoO2H2。25g,水 700mL 85喇酸 50mL 浓盐酸 100mL 小火 沸腾回流10h

2、,取下回流冷却器，在通风橱中参加硫酸锂 LiSO4 50g，水50mL和数滴浓 漠水99%，再微沸15min,以除去多余的漠冷却后仍有绿色需要再参加漠水，再煮沸除 去过量的漠，冷却，加水定容至 1000mL,混匀，过滤。制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕 色瓶内。 使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。 3.2 碳酸钠溶液 c NaCO =0.4mol/L 称取无水碳酸钠N&CO 42.4g，加水溶解并定容至 1000ml. 3.3 三氯乙酸 c CChCOOH =0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至 1000ml. 3.4氢氧化钠溶液 c NaOH =0.5mo

3、l/L 按GB601配制。 3.5 盐酸溶液 c HCl =1mol/L 及 0.1 mol/L 按GB601配制。 3.6缓冲溶液 a. 磷酸缓冲液pH=7.5,适用于中性蛋白酶。 称取磷酸氢二钠N&HPO.12H2。6.02g和磷酸二氢钠NaHPO. 2H2O 0.5g ,加水溶解 并定容至1000ml. b. 孚L酸缓冲液pH=3.0,适用于酸性蛋白酶 甲液 称取乳酸80%90% 10.6g，加水溶解并定容至 1000mL 乙液 称取乳酸钠70% 16g,加水溶解并定容至 1000ml. 使用溶液取甲液8mL乙液1mL混匀，稀释一倍，即成 0.05mol/l乳酸缓冲溶液。 c.

4、硼酸缓冲溶液pH=10.5,适用于碱性蛋白酶。 甲液 称取硼酸钠硼砂19.08g，加水溶解并定容至 1000mL 乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至 1000mL 使用溶液取甲液500ml,乙液400ml.,混匀，用水稀释至 1000mL。 3.7 10g/l 酪素溶液 称取酪素10.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/l氢氧化钠溶液假设酸性蛋白酶那么 用浓乳酸23滴湿润后，参加适量得各种适宜 pH值的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中边加 热边搅拌，直至完 全溶解，冷却后， 转入1000mL容量瓶，用适宜的pH值的缓冲溶液稀释至 刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 3

5、.8 100 g/mL L-酪氨酸标准溶液 a. 称取预先于 105C枯燥至恒重的 L-酪氨酸0.1000g，准确至0.0002g，用1 mol/L 盐酸 60mL溶解后定容至100mL即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 b. 吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液 10.00mL,用0.1mol/l 盐酸定容至100mL即得100 g/mL L- 酪氨酸标准溶液。 4仪器和设备 4.1恒温水浴40 C 0.2 Co 4.2分光光度计 应符合GB9721的规定。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 a. L-酪氨酸标准溶液：按表 A3配制。 表A3 2 P. 吕亏 酪氨酸标准溶液的浓度 g/mL 取100

6、 g/mL酪氨酸标准溶 液的体积 mL 取水的体积 mL 0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 b.分别取上述溶液各 1.00mL须做平行试验，各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL,福林试剂 使用液1.00mL,置于40C 0.2 C水浴中显色 20min,用分光光度计于波长 680nm 10mnt匕 色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度， 以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓 度C为横坐标，绘制标准曲线曲线应通过零点 。 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为 1时的酪氨酸的量g,既为吸光度常数 K 值。其K值应

7、在95100范围内。 5.2测定 1待测酶液的制备 a.称取酶粉12g,精确至0.0002g 或取液体酶1.00mL,用少量该酶的缓冲液溶解，并 用玻璃棒搅拌捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣局部再参加少量缓冲液，如此捣研 34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀。通过四层纱布过滤，滤液 根据酶活力再用一次缓冲液稀释至适当浓度，供测试用稀释至被测试液吸光值在 0.250.40 范围内。 b.酶粉测定时，稀释倍数参考表 4 液体酶液可参照表 4稀释。 酶活单位 总倍 数 第一次稀释 第二次稀释 2万 2000 2g 200mL 100 倍 5m 100mL 20 倍 3万 25

8、00 2g 500mL 250 倍 5m 50mL 10 倍 4万 4000 2g 200mL 100 倍 5m200mL 40 倍 5万 5000 2g 500mL 250 倍 5m 100mL 20 倍 8、10 万 10000 2g 500mL 250 倍 5m200mL 40 倍 (2)测定 a先将酪素溶液放入 40C 0.2 C恒温水浴中，预热 5min。 b按以下程序操作 于660nm波长，用10mmt匕色皿测其吸光度 c. 1.398和166蛋白酶，除反响与显色温度为 30 0.2 C外，其他操作同 5.2 ,标准曲线也 作同样处理。 5.3 计算 X X=Ax Kx 4/10

9、x n n=2/5 x Ax n n 式中，X X 一样品的酶活力，u /g (u/mL); 1 样品平行试验的平均吸光度； K吸光常数(K=97.09实验室测定值) 4反响试剂的总体积，mL; 10反响时间10min,以1min计； n n 一稀释倍数 5.4结果的允许差 平行试验相对误差不得超过 3% 需要准备的：基皮，面粉，水，纱布，福林试剂， 250ml三角瓶，每组10- 15支试管，分 光光度计，三氯乙酸， 磷酸缓冲液或水， 碳酸钠溶液，酪素，已传代好的试管斜面。 最好能镜检一下真菌菌丝的形态。 试管 A 空白 加酶液 1.00ml 40+0.2 C ,预热 2min 加三氯乙酸 2.00ml摇匀 40+0.2 C ,保温 10min 加酪素 1.00ml,摇匀 取出静置 10min,过滤 取 1.00ml滤液 加碳酸钠溶液 5.00ml 加福林试剂使用液 1.00 ml 40+0.2 C ,显色 20min 试管 B 酶试样，需作三个平行 加酶