4免疫组化技术-理论篇ppt课件

1、免疫组织化学理论篇）免疫组织化学理论篇）(immunohistochemistry)免疫组化的标记物免疫组化的标记物 酶标记酶标记 胶体金标记胶体金标记 荧光标记荧光标记 放射性标记放射性标记免疫组化的标记物免疫组化的标记物 酶标记：酶标记：应用最广泛应用最广泛常用标记物：常用标记物： - -辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP): (HRP): 染色时同时加底物染色时同时加底物H2O2H2O2和供氢体和供氢体DABDAB或或AECAEC，生成棕色，生成棕色DABDAB或红色或红色AECAEC） HRP+DAB HRP+DABH2H2）+H2O2=HRP+2H2O+H2O2=HRP+2H2O+

2、氧化型氧化型DABDAB呈色呈色 - -碱性磷酸酶碱性磷酸酶(ALP)(ALP)：以萘酚：以萘酚As-MsAs-Ms磷酸盐为底物磷酸盐为底物，快蓝，快蓝FB/FB/快红快红FRFR为呈色剂，生成蓝色为呈色剂，生成蓝色/ /红色沉淀。红色沉淀。主要用于内源性过氧化物酶多得血细胞和淋巴细胞主要用于内源性过氧化物酶多得血细胞和淋巴细胞 免疫组化的标记物免疫组化的标记物胶体金标记：胶体金标记： 以胶体金做标记物对组织或细胞内以胶体金做标记物对组织或细胞内的抗原进行定位、定量研究的方法。胶体金是的抗原进行定位、定量研究的方法。胶体金是一种特殊的金属颗粒，呈淡红至深红色，可在一种特殊的金属颗粒，呈淡红至深

3、红色，可在光镜下观察。胶体金颗粒大小不同，电子密度光镜下观察。胶体金颗粒大小不同，电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合免疫电镜观高，所以免疫胶体金技术特别适合免疫电镜观察。察。免疫组化的标记物免疫组化的标记物 荧光标记荧光标记: : 以荧光素做标记物以荧光素做标记物, ,与其相对应的抗原或抗体起反应后与其相对应的抗原或抗体起反应后, , 形成带有荧光素的免疫复合物上形成带有荧光素的免疫复合物上, ,在荧光显微镜下观察抗原在荧光显微镜下观察抗原抗体反应结合部位抗体反应结合部位, , 对组织中的抗原或抗体进行定位，定对组织中的抗原或抗体进行定位，定量分析。量分析。常用荧光素：常用荧光素：异硫氰酸

4、荧光素异硫氰酸荧光素Fluorescien isocynate FITCFluorescien isocynate FITC）：黄绿色）：黄绿色荧光荧光德克萨斯德克萨斯Texas red TRTexas red TR）：鲜红色）：鲜红色罗丹明罗丹明Rhodame TRITCRhodame TRITC红色红色花青花青5 5Cyanine CY5):Cyanine CY5):蓝色荧光蓝色荧光 免疫组化标记物免疫组化标记物放射性标记：放射性标记： 使用放射性同位素作为示踪物，应用放射性自使用放射性同位素作为示踪物，应用放射性自显影术对组织中的抗原进行分析。显影术对组织中的抗原进行分析。 免疫组化的检

5、测系统免疫组化的检测系统 l过氧化物酶抗过氧化物酶法（过氧化物酶抗过氧化物酶法（ PAP）l碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶APAAP）l卵白素卵白素-生物素复合物法生物素复合物法ABC）l链酶卵白素链酶卵白素-生物素法生物素法LSAB）l抗生物素蛋白链菌素抗生物素蛋白链菌素-生物素复合物生物素复合物SABC）l酶标聚合物法酶标聚合物法LDP如如EnVision法法l增强聚合物一步法增强聚合物一步法EPOS）l催化信号放大法（催化信号放大法（ CSA）石蜡切片标本的处理：石蜡切片标本的处理： 组织离体后尽快固定，切开固定效果好组织离体后尽快固定，切开固定效果好，固定液以，固定液以1

6、010福尔马林缓冲液为佳，固福尔马林缓冲液为佳，固定时间在定时间在4h-24h4h-24h之间，长时间固定会影响之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果。抗原决定簇的暴露，产生阴性结果。 标本的取材厚度以标本的取材厚度以2mm2mm为宜，梯度酒精为宜，梯度酒精脱水尽量彻底充分，二甲苯透明时间不宜脱水尽量彻底充分，二甲苯透明时间不宜长，长，1 13h3h为佳，透明过度会导致组织发硬为佳，透明过度会导致组织发硬发脆。浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应发脆。浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。充分。 切片通常以切片通常以3 34um4um的厚度为宜的厚度为宜, ,太厚易掉片太厚易掉片，细胞重

7、叠，对细胞膜阳性结果观察不理想。，细胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想。裱片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在裱片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在48485050），玻片用），玻片用APESAPES或多聚赖氨酸处理，以或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。增强粘附性。80 80 烘烤烘烤1 12h2h。冰冻切片的处理：冰冻切片的处理： 冰冻切片的组织抗原保存好，缺点是不易做出好冰冻切片的组织抗原保存好，缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象。通常的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象。通常以以5um5um的厚度为佳，冷风吹干后用纯丙酮固定的厚度为佳，冷风吹干后用纯丙酮固定2 2遍遍,

8、,干干燥置入燥置入4 4 冰箱短期保存，冰箱短期保存，2020冰箱长期干燥保冰箱长期干燥保存。存。 石蜡切片应用石蜡切片应用3的新鲜的新鲜H2O2进行封闭，进行封闭， 以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min。 内源性过氧化物酶的封闭内源性过氧化物酶的封闭热抗原修复的缓冲液热抗原修复的缓冲液 有多种不同的修复液，如有多种不同的修复液，如 pH6.0 pH6.0 柠檬酸缓冲液最常用）柠檬酸缓冲液最常用）、尿素、尿素、Tris-HClTris-HCl、商品化修复液等。、商品化修复液等。 碱性碱性 pH pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好。修复液常对绝大多数抗体的效果更好。 推荐使用：推荐使用：EDTA EDTA 缓冲液缓冲液 pH 8.0 pH 8.0 或或 Tris-EDTA Tris-EDTA 缓冲液缓冲液 pH 9.0 pH 9.0 是较好的常规修复液，可用于大多数热修复有效的是较好的常规修复液，可用于大多数热修复有效的抗体有选择性抗体有选择性, pH6.0, pH6.0缓冲液对抗体缓冲液对抗体CD7CD7可能获得结果最可能获得结果最佳）。佳）。PAP笔画圈时应在组织外围笔画圈时应在组织外围2mm左右，不宜太靠近左右，不宜太靠近组织。组织。滴加抗体时应从外