6遗传学与生理学结合的方法ppt课件

1、 前前 言言 对微生物的代谢途径及代对微生物的代谢途径及代谢网络进行有目的的改造从谢网络进行有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然是而提高氨基酸的产量仍然是现代生物工程学的一个主攻现代生物工程学的一个主攻目标。为了攻克这个目标，目标。为了攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完善就有必要对尚待进一步完善的细胞生理学、生物化学、的细胞生理学、生物化学、分子生物学及生物过程工程分子生物学及生物过程工程等学科的基本状况做一番描等学科的基本状况做一番描述，主要有如下几个话题述，主要有如下几个话题: 与生物工程相关的氨基酸产生与生物工程相关的氨基酸产生菌的相关途径的研究进展情况，菌的相关途径的研究进展情况，其

2、中必须包括这些途径的代谢调其中必须包括这些途径的代谢调节以及细胞的整个调节网络的研节以及细胞的整个调节网络的研究进展情况。究进展情况。 对所有的相关途径进行详细的代谢流对所有的相关途径进行详细的代谢流量分析。这涉及到底物进入细胞的碳架量分析。这涉及到底物进入细胞的碳架物流量，流经向心途径、中心代谢途径物流量，流经向心途径、中心代谢途径和离心途径的碳架物流量，以及代谢中和离心途径的碳架物流量，以及代谢中间产物流出细胞的碳架物流量间产物流出细胞的碳架物流量(the central and peripheral carbon fluxes)。还原力的。还原力的流量流量(redox flux)及能量流

3、量及能量流量(energy flux)。以协调和调节的方式对碳架流、氧以协调和调节的方式对碳架流、氧化还原反应的电子流、能量流进行导化还原反应的电子流、能量流进行导向，以提高底物的吸收能力、限制前向，以提高底物的吸收能力、限制前体物向支路途径的流量、减少中间产体物向支路途径的流量、减少中间产物的积累及副产物的形成，还要绕过物的积累及副产物的形成，还要绕过氧化还原平衡及能量平衡中可能出现氧化还原平衡及能量平衡中可能出现的难题。的难题。 传统的设计育种传统的设计育种(随机诱变加定向随机诱变加定向筛选筛选)，以及，以及DNA重组技术在设计育种重组技术在设计育种中的应用已经大大提高了微生物对氨中的应用

4、已经大大提高了微生物对氨基酸的生产能力，但人们对于氨基酸基酸的生产能力，但人们对于氨基酸产生菌的生理学与生物化学等产生菌的生理学与生物化学等 主要领主要领域的基础知识还相当匮乏。域的基础知识还相当匮乏。 目前可从以下几方面理解氨基酸目前可从以下几方面理解氨基酸的代谢基础：的代谢基础： 具有生物工程学重要性的微生物的具有生物工程学重要性的微生物的基本代谢途径及其对应的酶的性质；基本代谢途径及其对应的酶的性质；酶及其调节方式，途径及其调节方酶及其调节方式，途径及其调节方式；式；中心代谢途径及离心途径代谢流量中心代谢途径及离心途径代谢流量的定量分析；的定量分析；对跨膜传送对跨膜传送(底物吸收和产物分

5、泌底物吸收和产物分泌)的详尽的了解。的详尽的了解。 目的产物的合成途径是理解氨基酸目的产物的合成途径是理解氨基酸生产的前提和核心内容。相关的代谢途生产的前提和核心内容。相关的代谢途径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸的合成的专用途径，也包括提供前体碳的合成的专用途径，也包括提供前体碳架物的途径、从专用途径分流最终导致架物的途径、从专用途径分流最终导致副产物生成的分支途径、相应氨基酸自副产物生成的分支途径、相应氨基酸自身被降解的途径、以及那些提供还原力身被降解的途径、以及那些提供还原力和代谢能量的途径。和代谢能量的途径。 除了以上这些反映代谢途径基本除了以上这些反

6、映代谢途径基本信息的资料外，代谢流量的相对固定信息的资料外，代谢流量的相对固定的分布以及代谢流量的动力学响应同的分布以及代谢流量的动力学响应同样是至关重要的。这既涉及到中心代样是至关重要的。这既涉及到中心代谢途径提供碳架物质、还原力及代谢途径提供碳架物质、还原力及代谢能的代谢流的定量分析，又涉及谢能的代谢流的定量分析，又涉及到特定氨基酸专用的合成途径的代谢到特定氨基酸专用的合成途径的代谢流的定量分析。流的定量分析。 此外，底物吸收和目的产物输出等此外，底物吸收和目的产物输出等有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般也是极其重要的。除

7、大肠杆菌外，一般工业微生物底物吸收方面的知识是相当工业微生物底物吸收方面的知识是相当欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近年来才受到关注。方向性的跨膜反应的年来才受到关注。方向性的跨膜反应的机理、微生物能学及氨基酸分泌的调节机理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等方面的知识对于理解氨基酸生产过程等方面的知识对于理解氨基酸生产过程也是相当重要的。也是相当重要的。 我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生物

8、合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输物合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输送方面为数不多的研究工作，以及这方面送方面为数不多的研究工作，以及这方面研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的微生物代谢设计的新进展和新方法。微生物代谢设计的新进展和新方法。1. 氨基酸生产的代谢基础氨基酸生产的代谢基础2. 氨基酸生物合成的代谢流量氨基酸生物合成的代谢流量 分析分析3. 底物的跨膜吸收与氨基酸的底物的跨膜吸收与氨基酸的 跨膜输出跨膜输出4. 氨基酸生产的代谢设计氨基酸生产的代谢设计 氨基酸生产的代谢基础

9、氨基酸生产的代谢基础1.1 氨基酸的生物合成氨基酸的生物合成1.2 代谢产物生产的生理代谢产物生产的生理学学 1. 1 氨基酸生产的代谢基础氨基酸生产的代谢基础 氨基酸的生物合成涉及以下氨基酸的生物合成涉及以下5个方个方面：面： （1底物吸收；底物吸收；（2进入中心代谢途径前的准备途径；进入中心代谢途径前的准备途径；（3经中心代谢途径产生碳架化合物经中心代谢途径产生碳架化合物(氨基酸的前体化合物氨基酸的前体化合物)、还原力、还原力(如如NADPH、NADH)和代谢能和代谢能( ATP 和磷和磷酸烯醇式丙酮酸等酸烯醇式丙酮酸等)； （4通过同化通过同化(合成合成)途径将碳架化合物途径将碳架化合物

10、转化成目的氨基酸，此过程涉及到还原转化成目的氨基酸，此过程涉及到还原力与代谢能的供需平衡，同时也涉及主力与代谢能的供需平衡，同时也涉及主要载流途径与分支途径之间的关系；要载流途径与分支途径之间的关系； （5目的氨基酸的跨膜输出等；目的氨基酸的跨膜输出等；（6目的产物进一步代谢的途径。目的产物进一步代谢的途径。 谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成是研究得最为广泛的。图是研究得最为广泛的。图 2 列出了列出了谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物合成相关的途径及重要步骤的代谢合成相关的途径及重要步骤的代谢调节情况。调节情况。底物底物异化途径同化途径氨基酸副产

11、物降解途径氨基酸全局调节系统跨膜吸收碳架、还原力、代谢能跨膜输出重吸收反响调理图图1. 微生物细胞合成氨基酸的微生物细胞合成氨基酸的相关途径及代谢调节示意图相关途径及代谢调节示意图 其中，各相关酶及其中，各相关酶及途径水平上的代谢调节，途径水平上的代谢调节，以及整个细胞水平上的以及整个细胞水平上的全局调节对于代谢流的全局调节对于代谢流的导向和改造是至关重要导向和改造是至关重要的。对微生物整个代谢的。对微生物整个代谢网络进行有目的的改造网络进行有目的的改造和设计涉及到大范围的和设计涉及到大范围的遗传改造。遗传改造。 该同化该同化(合成合成)途径通过草酰乙酸途径通过草酰乙酸 (OAA)与中心代谢途

12、径相接，天冬氨酸与中心代谢途径相接，天冬氨酸是该族氨基酸的共同前体物。是该族氨基酸的共同前体物。 来自回补来自回补途径及途径及TCA环的草酰乙酸，环的草酰乙酸， 进入合成途进入合成途径并在天冬氨酸径并在天冬氨酸 -半醛半醛(ASA)处分为两处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另一条通往条支路，一条通往赖氨酸，另一条通往苏氨酸、蛋氨酸苏氨酸、蛋氨酸(甲硫氨酸甲硫氨酸)及异亮氨酸。及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天冬氨酸激酶该途径上主要调控点是天冬氨酸激酶(AK)，其他重要的酶包括高丝氨酸脱氢，其他重要的酶包括高丝氨酸脱氢酶酶(HDH)和苏氨酸脱氢酶和苏氨酸脱氢酶(TDH)。 再往后的流量控制点是是通

13、往赖再往后的流量控制点是是通往赖氨酸氨酸 DDP合酶合酶(见图中见图中DHDPS)以及赖以及赖氨酸的需能输出。要获得令人满意的氨酸的需能输出。要获得令人满意的结果，必须全面考虑这些方面，仅仅结果，必须全面考虑这些方面，仅仅对于个别反应对于个别反应(即便是最重要的调控点即便是最重要的调控点)进行改造并不是理想的方法，进行改造并不是理想的方法，Broer 等曾将脱敏的等曾将脱敏的AK的基因导入野生菌的基因导入野生菌中进行表达，但并未获得很令人满意中进行表达，但并未获得很令人满意的赖氨酸产量。的赖氨酸产量。 该途径上另一值得关注的该途径上另一值得关注的特征是从六氢吡啶二羧酸出发特征是从六氢吡啶二羧酸

14、出发合成二氨基庚二酸的旁路途径合成二氨基庚二酸的旁路途径的出现，借助于的出现，借助于 NMR 手段已手段已经得知，旁路的出现依赖于某经得知，旁路的出现依赖于某些代谢条件，特别是可利用的些代谢条件，特别是可利用的NH4+的存在。的存在。 另一个重要的方面是参与特定氨另一个重要的方面是参与特定氨基酸合成途径及与之相关的其他代谢途基酸合成途径及与之相关的其他代谢途径的酶的调节特性，包括酶活力的调节径的酶的调节特性，包括酶活力的调节和酶的表达的调节。特别是必须详细研和酶的表达的调节。特别是必须详细研究中间产物或终端产物对途径起点或分究中间产物或终端产物对途径起点或分支处的关键酶的调节。支处的关键酶的调

15、节。 图图2.2. 天冬族氨基酸的生物合成及代谢调节.(其中 表示反馈抑制； 表示反馈阻遏)IR缩写符号：缩写符号：ASA为天门冬氨酸为天门冬氨酸-半醛，半醛，H s e 为 高 丝 氨 酸 ，为 高 丝 氨 酸 ，SucAKPA为琥珀酰二氨为琥珀酰二氨基庚二酸；基庚二酸；AK为天冬氨为天冬氨酸激酶，酸激酶，DDPS为二氢吡为二氢吡啶二羧酸合酶，啶二羧酸合酶，HDH为为高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸脱氢酶，HK为为高丝氨酸激酶，高丝氨酸激酶，TDH为苏为苏氨酸脱氢酶，氨酸脱氢酶，AHAS为乙为乙酰羟酸合酶；酰羟酸合酶； PEPS为为PEP合成酶，合成酶，PK为丙酮为丙酮酸激酶，酸激酶，PC为丙酮酸羧

16、为丙酮酸羧化酶，化酶，OAADC为草酰乙为草酰乙酸脱羧酶，酸脱羧酶，PEPC为为PEP羧化酶，羧化酶，PEPCK为为PEP羧激酶。羧激酶。PYRAcCoAOAATCACTAHDHhomDDPSdapAAspAsp-PAKlysCASAHseIMetDDPSucAKPADAPLysHKthrBIleThrTDHilvAAHASilvBNIThrLysThrMetRMetRIle，Leu,ValRIleIleEMPPEPPEPCPEPCKPCOAADCPKPEPSGlcG6PPTS奇异三角区III 要想根据细胞粗提取液的测定要想根据细胞粗提取液的测定结果对这些酶的调控性质做出适当结果对这些酶的调控

17、性质做出适当的解释是靠不住的。这一方面是因的解释是靠不住的。这一方面是因为它们在这些条件下可能不稳定；为它们在这些条件下可能不稳定；另一方面，对于需要什么样的辅因另一方面，对于需要什么样的辅因子才能保持它们的活性或子才能保持它们的活性或(和和)它们它们在缓冲液中的稳定性，也知之甚少；在缓冲液中的稳定性，也知之甚少；而且特别是因为在抽提的过程中，而且特别是因为在抽提的过程中，那些参与胞内酶活性调节的必需因那些参与胞内酶活性调节的必需因子会丢失。子会丢失。 谷氨酸棒杆菌中存在谷氨酸棒杆菌中存在 - 酮戊二酮戊二酸脱氢酶便是一例。人们最初认为酸脱氢酶便是一例。人们最初认为这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存

18、在。这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。正因为如此，才出现了这样的假设，正因为如此，才出现了这样的假设，即：即：TCA 环在该处的中断引起环在该处的中断引起- 酮酮戊二酸的戊二酸的 “ 溢出溢出 ”， 最终导致谷最终导致谷氨酸的分泌。后来才弄清这个酶在氨酸的分泌。后来才弄清这个酶在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的，谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的，但是它似乎很不稳定。但是它似乎很不稳定。 另外，在关于代谢流的研究中另外，在关于代谢流的研究中有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中-酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了(dawn-regulated)，但这在细胞抽提，

19、但这在细胞抽提物中至今不能得到证实。进行详细物中至今不能得到证实。进行详细的代谢流量的代谢流量(包括相关中间产物的流包括相关中间产物的流量量)分析，或许是解决这一问题的唯分析，或许是解决这一问题的唯一办法。一办法。 正确描述代谢网络的主要节点的调正确描述代谢网络的主要节点的调控模式是十分必要的，但常常是十分困控模式是十分必要的，但常常是十分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和磷酸烯难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合模式就是最好的醇式丙酮酸节点的复合模式就是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中例子。谷氨酸棒杆菌中PEP、PYR和和OAA所构成的所构成的 “ 奇异三角区奇异三角区 ”（magi

20、c triangle是研究的热点是研究的热点 。GlcPEPPYRAcCoAOAAG6PGlc注：注：PK, PC,PEPC, PEPCK,OAADC,PEPS, PTS奇异三角区奇异三角区 PEP通过通过PYR和和AcCoA向向TCA环提环提供供C2单位，同时，单位，同时，PEP、PYR 以及以及 AcCoA 还通过回补反应（还通过回补反应（ 通过乙醛酸环通过乙醛酸环为为TCA环提供重要中间产物，这些回补环提供重要中间产物，这些回补反应对于以反应对于以TCA环代谢中间产物环代谢中间产物 为前体为前体的氨基酸的生产来说是非常必要的。的氨基酸的生产来说是非常必要的。 该区包含可能有多达七个酶的参

21、与，该区包含可能有多达七个酶的参与，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、丙、丙酮酸激酶酮酸激酶(PK)、 草酰乙酸脱羧酶草酰乙酸脱羧酶(OAADC)和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统移酶系统(PTS)都已得到鉴定，磷酸烯都已得到鉴定，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶醇式丙酮酸合成酶(PEPS)已被假定存在。已被假定存在。丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶(PC)的存在已得到代谢流的存在已得到代谢流量分析的实验数据的支持。量分析的实验数据的支持。 合成代谢途径通常受反馈抑制和合成代谢途径通常受反馈抑制和反

22、馈阻遏的严格调控，比如反馈阻遏的严格调控，比如 图图2 中的中的AK、HDH、TDH、AHAS等。不过，等。不过，相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途径的调节还是比较简单的。径的调节还是比较简单的。 研究表明，仅仅研究与合成途径直研究表明，仅仅研究与合成途径直接相关的酶的调节以及还原力和能量的接相关的酶的调节以及还原力和能量的供给，以及对供给，以及对“瓶颈处关键酶的解调瓶颈处关键酶的解调节或过量表达仍是不够的。中心代谢途节或过量表达仍是不够的。中心代谢途径和合成代谢途径，特别是合成代谢途径和合成代谢途径

23、，特别是合成代谢途径，同全局调控机制密切相关，如紧缩径，同全局调控机制密切相关，如紧缩控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、渗透压调节及生长阶段调节等。这些问渗透压调节及生长阶段调节等。这些问题对于氨基酸的合成非常重要，但对它题对于氨基酸的合成非常重要，但对它们了解得并不多。们了解得并不多。 氨基酸的生产中经常用到特定的氨氨基酸的生产中经常用到特定的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面，在分成基酸营养缺陷型菌株。一方面，在分成两支的氨基酸合成途径中，一个分支途两支的氨基酸合成途径中，一个分支途径的终端产物氨基酸的营养缺陷，通常径的终端产物氨基酸的营养缺陷，通常对另一分

24、支的终端产物氨基酸的合成起对另一分支的终端产物氨基酸的合成起促进作用。促进作用。(其中 表示反馈抑制； 表示反馈阻遏)图图3 3天冬族氨基酸过量合成的机理IRPYRAcCoAOAATCACTAHDHhomDDPSdapAAspAsp-PAKlysCASAHseMetDDPSucAKPADAPLysHKthrBIleThrTDHilvAAHASilvBNThrLysThrMetRMetIle,Leu,ValIleIleEMPPEPPPCPCKPCODCPKPPSGlcG6PPTS比如图比如图 3 中，谷中，谷氨酸棒杆菌中高氨酸棒杆菌中高丝氨酸缺陷或苏丝氨酸缺陷或苏氨酸缺陷的赖氨氨酸缺陷的赖氨酸生

25、产菌株，大酸生产菌株，大肠杆菌中甲硫氨肠杆菌中甲硫氨酸缺陷、二氨基酸缺陷、二氨基庚二酸缺陷或异庚二酸缺陷或异亮氨酸缺陷的苏亮氨酸缺陷的苏氨酸生产菌株。氨酸生产菌株。RRIIIII 另一方面，某些化合物对菌体生长的另一方面，某些化合物对菌体生长的限制，不论是氨基酸或其他化合物限制，不论是氨基酸或其他化合物(比如磷比如磷酸盐酸盐), 都可能成为有利于特定生物过程的都可能成为有利于特定生物过程的最优控制的技术条件。最优控制的技术条件。 尽管连续培养得到的结果表明，赖尽管连续培养得到的结果表明，赖氨酸的生成是与细胞的生长是相关联的。氨酸的生成是与细胞的生长是相关联的。但在有效分泌的生理条件下，氨基酸生

26、产但在有效分泌的生理条件下，氨基酸生产菌一般都处于生长受限制的状态。菌一般都处于生长受限制的状态。 然而，对于与生长限制相关的中心然而，对于与生长限制相关的中心代谢代谢(central metabolism)和外围代谢和外围代谢(peripheral metabolism)的改变如何影的改变如何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；这响氨基酸的有效生成，还不很清楚；这或许与影响到许多不同的基因和操纵子或许与影响到许多不同的基因和操纵子的调节网络的调节网络(regulatory networks)的作的作用有关。用有关。谷氨酸的生产可以建立在完全谷氨酸的生产可以建立在完全不同的细胞代谢态势下。许多方

27、法不同的细胞代谢态势下。许多方法可诱导其分泌，包括生物素亚适量可诱导其分泌，包括生物素亚适量法法(用于谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌用于谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌是生物素缺陷型是生物素缺陷型)、添加胺类表面活、添加胺类表面活性剂性剂(如吐温如吐温40和和60)、在菌体生长、在菌体生长期添加青霉素、甘油或脂肪酸缺陷期添加青霉素、甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制条件下生长和采用温度菌株在限制条件下生长和采用温度敏感突变株等。敏感突变株等。 很显然，所使用的这些很显然，所使用的这些方法都对细胞质膜或细胞壁方法都对细胞质膜或细胞壁有一定影响，但使细胞膜通有一定影响，但使细胞膜通透性发生变化的机理是不完透性发生变化的

28、机理是不完全一样的。全一样的。谷氨酸的分泌曾被认为是因为相谷氨酸的分泌曾被认为是因为相对简单和直接的代谢改变即影响细对简单和直接的代谢改变即影响细胞膜性质的而引起的，然而最近发胞膜性质的而引起的，然而最近发现在没有紧缩效应的大肠杆菌现在没有紧缩效应的大肠杆菌rel A 基因缺损中，通过氨基酸饥饿法可基因缺损中，通过氨基酸饥饿法可以触发细胞借助于载体的谷氨酸分泌以触发细胞借助于载体的谷氨酸分泌活性，这表明全局调节机制对分泌的活性，这表明全局调节机制对分泌的影响是存在的。影响是存在的。 1.2 氨基酸生产的微生物生理学氨基酸生产的微生物生理学对于经氧化还原过程实现氨对于经氧化还原过程实现氨基酸生产

29、的重要性，早有所认识。基酸生产的重要性，早有所认识。但对其中大多数现象至少在分但对其中大多数现象至少在分子水平上仍未很好理解。对一子水平上仍未很好理解。对一般的代谢调节现象做如下五点概般的代谢调节现象做如下五点概述，可能将有利于我们从生理学述，可能将有利于我们从生理学的角度去理解代谢中间产物的生的角度去理解代谢中间产物的生产。产。 （1） 氨基酸的生产与菌体生长之间氨基酸的生产与菌体生长之间的关系尚未解决耦合与否？）。的关系尚未解决耦合与否？）。（2） 限制生长条件下的微生物生理。限制生长条件下的微生物生理。 在缓慢生长或非生长条件下，有目的在缓慢生长或非生长条件下，有目的地控制底物的吸收与代

30、谢的速率，能地控制底物的吸收与代谢的速率，能提高发酵工业生产效率。因此，要用提高发酵工业生产效率。因此，要用分子技术或生化技术对此进行深入细分子技术或生化技术对此进行深入细致的研究，以阐明在限制生长条件下，致的研究，以阐明在限制生长条件下，微生物的生理背景同工业发酵过程的微生物的生理背景同工业发酵过程的应用必定密切相关的道理。应用必定密切相关的道理。（3溢出代谢的概念：当这个生理学溢出代谢的概念：当这个生理学的新见识同过量生产的特定代谢条件，的新见识同过量生产的特定代谢条件，在分子水平上发生相互关联的时候，在分子水平上发生相互关联的时候，溢出代谢溢出代谢(overflow metabolism

31、)的概念的概念是值得关注的。是值得关注的。 例如，在过量生产某种产物的代谢例如，在过量生产某种产物的代谢条件下，已观察到某些特有的代谢中间条件下，已观察到某些特有的代谢中间产物，如产物，如 丙酮酸、丙酮酸、- 酮戊二酸等会大量酮戊二酸等会大量分泌。这些特定的代谢中间产物先在细分泌。这些特定的代谢中间产物先在细胞内累积胞内累积(这取决于碳源的性质和生长限这取决于碳源的性质和生长限制制)，然后分泌到细胞外，然后分泌到细胞外(如果细胞具备如果细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机构或有输允许这些代谢中间产物跨膜机构或有输送系统存在送系统存在)，从而抵消在碳架物质、还，从而抵消在碳架物质、还原当量和代谢能

32、等在代谢中的不平衡。原当量和代谢能等在代谢中的不平衡。（4代谢不平衡：代谢不平衡： 细胞的代谢不平衡指碳细胞的代谢不平衡指碳架物质不平衡，特别是指代谢能和还原当量架物质不平衡，特别是指代谢能和还原当量的不平衡。代谢不平衡的条件常常涉及到溢的不平衡。代谢不平衡的条件常常涉及到溢流阀流阀(overflow valves)的功能。事实上，代的功能。事实上，代谢网络之所以能够在失去平衡的条件下谢网络之所以能够在失去平衡的条件下(如如大量氨基酸的过量合成大量氨基酸的过量合成)得以维持，是因为得以维持，是因为它具备使通常情况下它具备使通常情况下(指碳架物质和代谢能指碳架物质和代谢能限制的条件下限制的条件下

33、)耦合在一起的代谢流脱钩的耦合在一起的代谢流脱钩的灵活性。灵活性。 好几个术语，如好几个术语，如 “ 解耦联解耦联 ”、“ 代谢能溢出代谢能溢出 ” 等就是用来说明这种灵活等就是用来说明这种灵活性的。性的。 实际上，曾有人这样描述过细实际上，曾有人这样描述过细菌的这种行为：菌的这种行为：“可以推断，细菌可以推断，细菌对于代谢能过剩的解决办法是把它对于代谢能过剩的解决办法是把它浪费浪费/用掉用掉”。然而，对特定条件下。然而，对特定条件下(如与不生长发生耦合或耦合欠佳的如与不生长发生耦合或耦合欠佳的氨基酸的生产条件下氨基酸的生产条件下)代谢能耗散的代谢能耗散的机制，尚待进行深入的研究。机制，尚待进

34、行深入的研究。 在细菌中存在很多能够浪费代谢在细菌中存在很多能够浪费代谢能的反应和反应组合。如能的反应和反应组合。如K+ 或或NH4+ 的无效循环，的无效循环，(在某些情况下也会发生在某些情况下也会发生)质子的无效循环。这样的代谢能溢出质子的无效循环。这样的代谢能溢出反应表明，合成代谢与分解代谢之间反应表明，合成代谢与分解代谢之间存在不平衡存在不平衡, 而这正是氨基酸生产菌而这正是氨基酸生产菌种所希望得到满足的条件。种所希望得到满足的条件。 其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨酸生产的能量溢出问题已有过争论，酸生产的能量溢出问题已有过争论，赖氨酸生产的最大转化率可能受到过赖

35、氨酸生产的最大转化率可能受到过量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的高度增加使代谢发生改变，引起代谢高度增加使代谢发生改变，引起代谢能的过剩。因此，可以认为高的能量能的过剩。因此，可以认为高的能量耗散能力适合于代谢中间产物耗散能力适合于代谢中间产物(如氨如氨基酸基酸)的过量合成。的过量合成。（5有关渗透适应性问题：有关渗透适应性问题： 在分批培养的条件下，发酵液中在分批培养的条件下，发酵液中溶质溶质(碳源和能源碳源和能源)的浓度会发生很大的浓度会发生很大的变化，那么了解和控制有关渗透适的变化，那么了解和控制有关渗透适应性的代谢过程显然就相当重要了。应性的代谢过程显然就

36、相当重要了。细胞外部渗透压细胞外部渗透压(实际上是水活度实际上是水活度)的的改变不但对细胞的代谢，而且对底物改变不但对细胞的代谢，而且对底物的吸收、产物的释放都会产生有效的的吸收、产物的释放都会产生有效的影响。影响。 关于真细菌这方面的基本机制的关于真细菌这方面的基本机制的研究，可能促使我们去选育已丧失以研究，可能促使我们去选育已丧失以下两种能力的菌株：下两种能力的菌株： 一是丧失对不利于生产的渗透保一是丧失对不利于生产的渗透保护物质如海藻糖的合成能力；二护物质如海藻糖的合成能力；二是丧失对代谢和输送反应做出渗透压是丧失对代谢和输送反应做出渗透压响应的能力。响应的能力。 2. 氨基酸生物合成的

37、代谢流量分析氨基酸生物合成的代谢流量分析 除了代谢途径及其调节机制和除了代谢途径及其调节机制和已知途径的化学计量分析以外，稳已知途径的化学计量分析以外，稳态代谢流量和流量动力学分析对于态代谢流量和流量动力学分析对于理解氨基酸生产的代谢网络也越来理解氨基酸生产的代谢网络也越来越重要。越重要。 这既涉及到提供碳架物质、这既涉及到提供碳架物质、 氧氧化还原当量和代谢能的中心代谢途化还原当量和代谢能的中心代谢途径，也涉及到那些通往特定氨基酸径，也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代谢途径。代谢流量分析和的合成代谢途径。代谢流量分析和代谢流的动力学分析的一个主要目代谢流的动力学分析的一个主要目的在于鉴定代谢

38、网络中所一般认为的在于鉴定代谢网络中所一般认为的限速步骤。的限速步骤。 CO2NADP+NADPH+NADP+NADPH+6-P-GF-6-PFDPDHAPGA-3-P1,3-2P-GA3-P-GA2-P-GAPEPPYRAcCoACTASCAOAAICA -KGScCoAFMAMLAGOAGlcG6P6-P-GARu-5-PX-5-PR-5-PE-4-PSed-7-PPRPPUMPCTPdTMPAMPGMPDNA,RNAATPPR-ATPPR-AMPBBMBBMIGPPRAICIAPHPHOLHisIGlu -KGH2OPiHALNAD+NAHD+NAD+NAHD+GlnGluGlu -KG

39、NADPH+NH3ATPADPADPATPNADPH+NADP+PiATPADPNAD+AspGluArgProCHOTrpPRPP PPiSerGluPREBTyrPheGluGluSerCysS2-SO42-AlaGluGOAGlyAMPGMPPRPPFig. Metabolic Pathyways for the Biosynthesis of Amino AcidsFADH2NADH+GTPCO2NADH+NADH+CO2HisEDAHPGlcPEPPYRASAATPADPAsp-PNADPH+NADP+DDPNADPH+NADP+HseThrIleMetLysIDAPH4DSCAGl

40、u -KGNADPH+NH3SCACO2LysEOrnCitGluAsp -AL -OIVAValGluNADPH+NADP+AcCoALeuGluH2OppspykFppcpckpcodc 主要可通过两种不同的方法定量地、主要可通过两种不同的方法定量地、完整地描述细胞的代谢网络：完整地描述细胞的代谢网络：（1描述各步反应描述各步反应(酶酶)的动力学属性及的动力学属性及其他有用数据的方法；其他有用数据的方法；（2直接测定底物、产物及一些代表直接测定底物、产物及一些代表性中间产物的方法，如物料平衡性中间产物的方法，如物料平衡(代谢物代谢物平衡技术。平衡技术。 如果要对代谢网络做出完整描述并如果要

41、对代谢网络做出完整描述并且对各步反应及其代谢物流量的重要程且对各步反应及其代谢物流量的重要程度做出评价，就要弄清每一个酶的的调度做出评价，就要弄清每一个酶的的调节节(包括对酶的活性的调节和对表达水包括对酶的活性的调节和对表达水平的调节平的调节)情况，这当然是不容易如愿情况，这当然是不容易如愿的，但已被实践证明，以下简化的策略的，但已被实践证明，以下简化的策略也可以用来对代谢流进行定量的描述。也可以用来对代谢流进行定量的描述。 第一种方法，在某些场合下用代谢控第一种方法，在某些场合下用代谢控制理论来对有关生物技术学的研究进行反制理论来对有关生物技术学的研究进行反应动力学的分析。其基本原理就是分析

42、酶应动力学的分析。其基本原理就是分析酶活力或酶浓度的微量变化对代谢流量及代活力或酶浓度的微量变化对代谢流量及代谢物浓度的影响，进而确定特定的流量控谢物浓度的影响，进而确定特定的流量控制系数制系数(flux control coefficients)，该系数，该系数反映特定反应对复杂途径的影响程度。反映特定反应对复杂途径的影响程度。 第二种方法，代谢物平衡技术。其第二种方法，代谢物平衡技术。其模式的推导建立在对底物、产物及某些模式的推导建立在对底物、产物及某些重要中间产物的直接测定上。这种方法重要中间产物的直接测定上。这种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖氨酸的研已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖氨酸的研究

43、中得到了应用。如果所研究的代谢网究中得到了应用。如果所研究的代谢网络的途径结构已知，又假定进行稳态代络的途径结构已知，又假定进行稳态代谢，那么就可通过准确测得的所有进出谢，那么就可通过准确测得的所有进出细胞代谢流的流量，推导出特定途径的细胞代谢流的流量，推导出特定途径的代谢流量分布。代谢流量分布。 但用这类方法计算，很难把代谢环但用这类方法计算，很难把代谢环路路(如如TCA环环)、重要节点、重要节点(如如 PYR、 PEP节点节点)、以及平衡反应、以及平衡反应(酶促反应的正向和酶促反应的正向和逆向流量逆向流量)的特殊重要性包罗在内。这是的特殊重要性包罗在内。这是这类方法的局限性。为了弥补这种局

44、限这类方法的局限性。为了弥补这种局限性，近年已有几种技术用到这种类型的性，近年已有几种技术用到这种类型的分析中去了。分析中去了。 如采用示踪流量实验如采用示踪流量实验(tracer flux experiments)技术、快速取样技术及核技术、快速取样技术及核磁共振磁共振(NMR)技术可获得关于代谢流分技术可获得关于代谢流分布的另外一些信息，如代谢网络的有关布的另外一些信息，如代谢网络的有关组成部分中的流量分布、胞内不同代谢组成部分中的流量分布、胞内不同代谢产物的累积量，以及它们各自随时间而产物的累积量，以及它们各自随时间而变化的情况。变化的情况。 有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长有人分析了谷

45、氨酸棒杆菌在对数生长期、赖氨酸生产期期、赖氨酸生产期(生物素量足够生物素量足够)及谷氨及谷氨酸生产期酸生产期(生物素限量生物素限量)等条件下胞内代谢等条件下胞内代谢流的不同分布情况流的不同分布情况(下列图下列图)，它们以，它们以13C标标记的葡萄糖为碳源进行分批发酵，然后运记的葡萄糖为碳源进行分批发酵，然后运用用 NMR测定标记了的代谢物，同时运用测定标记了的代谢物，同时运用质量平衡法进行计算，得到了图中的流量质量平衡法进行计算，得到了图中的流量分布图或称代谢断面分布图或称代谢断面(sections of the metabolism)图。图。 GluG6PF6PGA3PPYRR5PCO2OA

46、ACO2GOABiomass HMP TCA CO2回补 EMP1005940733852171351810(60)14 15436133A. 对数生长期GluG6PF6PGA3PPYRR5PCO2OAACO2GOABiomass HMP TCA CO2回补 EMP100524783989821341816(80)6 15335215LysCO21216244B. 赖氨酸生成期GluG6PF6PGA3PPYRR5PCO2OAACO2GOABiomass HMP TCA CO2回补 EMP100831731497000322133(25)0 164434411C. 谷氨酸生成期Glu55 由图可

47、见，在不同条件下，由图可见，在不同条件下，流量发生了显著的变化。酵解流量发生了显著的变化。酵解途径的途径的HMP旁路的流量分布在旁路的流量分布在赖氨酸生成时增加，而在谷氨赖氨酸生成时增加，而在谷氨酸生成时则下降。在氨基酸分酸生成时则下降。在氨基酸分泌的情况下，回补反应变得更泌的情况下，回补反应变得更重要一些。重要一些。 另一个长期以来不能确定的另一个长期以来不能确定的问题也在研究中得到了解决，也问题也在研究中得到了解决，也就是氨基酸生成条件下就是氨基酸生成条件下GOA环环活力的问题，在氨基酸生成条件活力的问题，在氨基酸生成条件下，下，GOA环的活力实测是非常环的活力实测是非常低的。低的。 下图

48、为在不同转化率时的理下图为在不同转化率时的理论流量分布图。论流量分布图。CO2CO2CO25125课外学习参考资料：课外学习参考资料：Metabolic Pathway Synthesis (p288)Metabolic Flux Analysis (p309)in Metabolic Engineering, 2019Metabolic Flux Balance Analysis (p13) in Metabolic Engineering, 2019 3. 底物的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出底物的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出 底物的吸收和产物的输出对于氨基底物的吸收和产物的输出对于氨基酸的生成

49、是非常重要的。对于某些细菌，酸的生成是非常重要的。对于某些细菌，特别是大肠杆菌对底物吸收的不同机制特别是大肠杆菌对底物吸收的不同机制已作了详尽的研究，但对于其它生物工已作了详尽的研究，但对于其它生物工程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗糖及羧酸的吸收机制则知之甚少。而关糖及羧酸的吸收机制则知之甚少。而关于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出细于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出细胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。 近年的研究表明，在氨基酸生产近年的研究表明，在氨基酸生产的条件下，的条件下， “氨基酸被动扩散跨过细氨基酸被动扩散跨过细胞质膜

50、胞质膜” 这一设想是武断的。谷氨酸这一设想是武断的。谷氨酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、异棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中谷亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的输氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的输送过程，而且不纯粹是被动的。而运送过程，而且不纯粹是被动的。而运动发酵单胞菌动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的的重组菌株中，丙氨酸则是依靠简单扩重组菌株中，丙氨酸则是依靠简单扩散机制来分泌。散机制来分泌。 详细了解特定氨基酸跨过细胞质膜详细了解特定氨基酸跨过细胞质膜渗透屏障的机理，对于提高发酵过程的渗透屏障的机理，对于提高发酵过程

51、的效率和转化率也非常重要。尽管采用细效率和转化率也非常重要。尽管采用细菌来生产氨基酸往往可以获得极高的胞菌来生产氨基酸往往可以获得极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未意识到这至外氨基酸浓度，人们却并未意识到这至少部分是由于细胞向载体系统所催化的少部分是由于细胞向载体系统所催化的分泌反应提供了代谢能的结果。这一点分泌反应提供了代谢能的结果。这一点已被有关赖氨酸和异亮氨酸分泌的研究已被有关赖氨酸和异亮氨酸分泌的研究所证实所证实 。 下图显示了谷氨酸棒杆菌在下图显示了谷氨酸棒杆菌在异亮氨酸生产过程中发生的不同异亮氨酸生产过程中发生的不同流量。所观察到的异亮氨酸的净流量。所观察到的异亮氨酸的净产量实际上是

52、借助于载体而形成产量实际上是借助于载体而形成的向外分泌的流量、向内吸纳的的向外分泌的流量、向内吸纳的流量及扩散流量的代数和。流量及扩散流量的代数和。 在分批发酵的开始阶段，异亮在分批发酵的开始阶段，异亮氨酸从胞内向胞外扩散，但随着胞外氨酸从胞内向胞外扩散，但随着胞外异亮氨酸浓度的增加，其扩散方向也异亮氨酸浓度的增加，其扩散方向也发生改变，并越来越多地抵消异亮氨发生改变，并越来越多地抵消异亮氨酸载体系统的分泌作用。酸载体系统的分泌作用。 这一方面解释了所能获得的最这一方面解释了所能获得的最大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜的透性常数，以及分泌和吸收载体的透性常数，以及分

53、泌和吸收载体的活力；另一方面，由此可看出在的活力；另一方面，由此可看出在生产条件下可能发生由代谢能驱动生产条件下可能发生由代谢能驱动的分泌与被动回流构成的无效循环的分泌与被动回流构成的无效循环是浪费代谢能的。是浪费代谢能的。 一般说来，抵消氨基酸的产量的氨一般说来，抵消氨基酸的产量的氨基酸的吸收系统对于整个过程并不重要。基酸的吸收系统对于整个过程并不重要。用谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，吸收系用谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，吸收系统的活力非常低。最近发现，芳香族氨统的活力非常低。最近发现，芳香族氨基酸的吸收系统过量表达的结果是相应基酸的吸收系统过量表达的结果是相应氨基酸的吸收的增加，实际上产物的转氨基

54、酸的吸收的增加，实际上产物的转化率降低了。总之，深入了解氨基酸吸化率降低了。总之，深入了解氨基酸吸收和分泌的能学及调控的机理对于定量收和分泌的能学及调控的机理对于定量地理解氨基酸的生产过程是极为重要的。地理解氨基酸的生产过程是极为重要的。 在进行包括输送途径的代谢流量的详细分析时，特别是在比较野生株和生产菌株，或特定菌株在生产或非生产条件下的性质时，已引出了几个重要的概念。 单靠单靠“瓶颈瓶颈” 酶的过量表达并不酶的过量表达并不能获得理想的高产结果。在通常情况下，能获得理想的高产结果。在通常情况下，仅仅是从底物到产物整条途径的某仅仅是从底物到产物整条途径的某 “ 瓶颈瓶颈 ” 酶的过量表达并不

55、能获得理酶的过量表达并不能获得理想的高产结果。对生产菌株的分析表明，想的高产结果。对生产菌株的分析表明，为了使得特定氨基酸能够稳定而有效地为了使得特定氨基酸能够稳定而有效地分泌，应该对酶和途径进行细致的调整。分泌，应该对酶和途径进行细致的调整。只有当一系列酶发生了协调的改变，才只有当一系列酶发生了协调的改变，才能避免细胞内代谢中间产物库的亏空或能避免细胞内代谢中间产物库的亏空或积压，避免代谢不平衡或不必要的副反积压，避免代谢不平衡或不必要的副反应。应。 用谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和酵母用谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和酵母菌进行了有关芳香族氨基酸发酵成功的研菌进行了有关芳香族氨基酸发酵成功的研究。关于谷

56、氨酸棒杆菌、大肠杆菌的代谢究。关于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌的代谢途径工程研究的成果已见发表。途径工程研究的成果已见发表。 为提高色氨酸的产量，已对谷氨为提高色氨酸的产量，已对谷氨酸棒杆菌按部就班地进行了一系列的酸棒杆菌按部就班地进行了一系列的遗传调节，包括：色氨酸操纵子遗传调节，包括：色氨酸操纵子(已已被解除调节的被解除调节的)的基因的过量表达、的基因的过量表达、去除调节子及弱化序列的控制；切断去除调节子及弱化序列的控制；切断通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路、增加通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路、增加前体物如前体物如PEP、E-4-P和丝氨酸等的和丝氨酸等的供应、破坏色氨酸酶降解色氨酸的活供应、破坏色氨酸酶

57、降解色氨酸的活性等等。性等等。HMPEMPPEPE4PDAHP莽草酸分支酸预苯酸邻氨基苯甲酸PheTyrTrpPRPPSer降解产物大肠杆菌中色大肠杆菌中色氨酸合成途径氨酸合成途径的简图的简图该图略去了酶该图略去了酶活力及基因表活力及基因表达水平上的调达水平上的调控机制，实际控机制，实际上在生产菌株上在生产菌株中，这些调控中，这些调控机制都已被解机制都已被解除。除。 虽然一般用于芳香族氨基酸生产虽然一般用于芳香族氨基酸生产的微生物并不是酿酒酵母，但在概念的微生物并不是酿酒酵母，但在概念探讨方面，用酵母进行的色氨酸生物探讨方面，用酵母进行的色氨酸生物合成的研究是引人关注的。实验结果合成的研究是引

58、人关注的。实验结果表明，即使在无分支的途径中，想靠表明，即使在无分支的途径中，想靠单个酶单个酶 “上调上调up-modulation）”，增加整条途径的流量往往是无济于事增加整条途径的流量往往是无济于事的。的。 正如基于流量控制理论的理论正如基于流量控制理论的理论解释，只有几种酶活性协同地提高，解释，只有几种酶活性协同地提高，才有可能大幅度增加流向色氨酸的才有可能大幅度增加流向色氨酸的全程的流量。这个发现为许多途径全程的流量。这个发现为许多途径中 的 关 于中 的 关 于 “ 分 摊 式 的 代 谢 控 制分 摊 式 的 代 谢 控 制distributive metabolic contro

59、l）”的更加笼统的描述提供了支持；同的更加笼统的描述提供了支持；同时也对仍在广泛使用的代谢途径的时也对仍在广泛使用的代谢途径的所谓所谓“瓶颈识别方法做出了一个瓶颈识别方法做出了一个重要的限制。重要的限制。 4. 氨基酸生产的代谢设计氨基酸生产的代谢设计 氨基酸生产上广泛使用棒状杆菌，这一方面有历史的原因；另一方面，与其他微生物如大肠杆菌相比较，棒状杆菌在工业生产上具有明显的优势。 棒状杆菌的代谢调节相对简单。棒状杆菌的代谢调节相对简单。肠道细菌中特定反应的酶及特定基肠道细菌中特定反应的酶及特定基质的载体系统具有多重性，而棒状质的载体系统具有多重性，而棒状杆菌中则没有；棒状杆菌的代谢调杆菌中则没

60、有；棒状杆菌的代谢调控模式也比大肠杆菌要简单得多。控模式也比大肠杆菌要简单得多。然而，利用肠道细菌进行氨基酸菌然而，利用肠道细菌进行氨基酸菌种的育种的优势则在于可以方便地种的育种的优势则在于可以方便地应用成熟的现代应用成熟的现代 DNA 重组技术，重组技术，有效地进行氨基酸生产菌种的改造。有效地进行氨基酸生产菌种的改造。 针对于不同的目的和不同水平的复杂性，在考虑代谢设计的策略时应区别对待。 代谢设计的目标在于： （1提高已建立的途径或过程的效率； （2将代谢流导向至新插入的途径。 第一个目标可通过多种手段来实现：第一个目标可通过多种手段来实现：扩展底物利用的范围；扩展底物利用的范围；改善生长