基因工程工具酶

1、工具酶工具酶 第四章第四章 工具酶工具酶 工具酶工具酶基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、连接、切割和修饰的各种酶。包括：包括：限制酶,核酸酶.聚合酶, 连接酶, 激酶, 磷酸酶, 第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction Endonuclease）一. 细菌的限制一修饰现象限制一修饰现象被发现瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论： 核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身DNAArber首次从 E.Coli B菌株中分离出型限制酶EcoB美Hopkings大学 H.Smith 从流感嗜血菌中分离 型 限制酶 Arber, Smith获得1978

2、 年Nobel奖二.限制酶系统分类和命名 1985年后大量限制酶被发现，已从350多种微生物中发现2000多种限制酶，识别108种不同的特定序列限制性内切酶的分类 型: 特异识别、随机切割 型：特异识别、同点切割 型：特异识别、异地切割通常所指的限制酶即类酶 限制酶特性比较限制酶特性比较 I型 II型 III型限制与修饰由同一酶承担 是 否 是酶反应辅助因子ATP.mg+ SAM mg+ ATP.mg+SAM识别位点特性 / 4-6bp回文对称切割位点 距离1kb 识别点中 距3 端24-26bp举例 EcoB BamHI EcoPL识别位点TGAN8TGCT G GATTC AGACC克隆工

3、作中用途 无 有 无SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸三三. .系统命名法系统命名法 限制性内切酶的命名方法 属名 种 变种 序数 1字母 2字母 1字母 (EcoRI) E co R I (HindIII)H in d III (BamHI) B am H I 四.一般限制酶的识别特点1. 大多数是严格的识别顺序，少数可变2. 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长3. 多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位 点在切割位点之外，具旋转对称性 4bp HpaC CGG Hae GG CC 5bp Ava G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamH G GATTC SmaCCC G

4、GG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstXCCANNNNN NTGC N=A, T, G, C五. 限制酶的切割末端 5 粘端（EcoR I） 3 粘端（Pst I） 平端 （Sma I）六.限制酶产生的末端的连接 1. 匹配粘端: 直接连接 2. 平末端: 万能连接 3. 不匹配粘端： S1 Nuclease切去突出端 或Klenow补平七.识别位点与切割方式之间的关系 1.识别不同，切割不同 eg: BamHI EcoRI -G GATC C- - A GATCT- -C CTAG G- - T CTAG A- 2.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶) eg: Ba

5、mHI Bg1 - A GATCT -G GATCC - T CTAG A -CCTAG G3.识别相同，切割不同 eg: SmaI XmaI -CCC GGG-C CCGG -GGG CCC- -G GGCC C-4识别相同，切割相同同工酶 同裂酶 eg: Hpa Msp -CC GG- -C * C GG- -GG CC- -G G CC-八.限制酶反应的影响因素1. 温度：一般37 C，有例外,如：SmaI 25 C， BclI 50 C，TaqI 65 C2. 缓冲液：高、中、低盐之分 (NaCl)3. 时间：1-1.5小时4. 反应体积和甘油浓度：酶8.0) 存在有害试剂(1%乙 醇

6、, DMSO, 乙二醇) 阳离子变化:Mn+, Co+, Zn+, Cu+代替mg+酶的灭活酶的灭活1.加热2.酚抽提 第二节 修饰酶一一. .分类分类细菌DNA聚合酶*E. Coli DNA聚合酶（全酶） *Klenow酶T4噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶 *测序酶（修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶 *反转录酶 末端脱氧核苷酸转移酶依赖于DNA的RNA聚合酶 SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶 T4噬菌体RNA聚合酶连接酶 E. Coli DNA连接 *T4 DNA连接酶 T4噬菌体 RNA连接酶激酶 T4噬菌体多核苷酸激酶磷酸酶*碱性磷酸酶核酸酶 Ba

7、131核酸酶 S1核酸酶 绿豆核酸酶 RNaseA RNaseT1 DNaseI EXo 噬菌体外切核酸酶二二. .聚合酶聚合酶1.1. E. Coli DNA聚合酶 活性:（1）53 DNA聚合酶活性 （2）35 核酸外切酶活性 （3）53 核酸外切酶活性 主要用途：切口平移法标记DNA2. Klenow酶 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解 E. Coli DNA聚合酶得到的该酶的大片段 活性：（1）53 聚合酶活性 （2）35 外切核酸酶活性 主要用途： (1)补平3 凹端 (2)补平3 凹端，末端标记 (3)合成cDNA第二链 (4)体外诱变中从模板合成DNA第二链3. T4 噬菌体DNA聚

8、合酶 活性：（1）53 聚合酶活性 （2）35 外切核酸酶活性, 比 Klenow 酶强200倍 用途: 3突出端切平 4. T7噬菌体DNA聚合酶 活性： 53 聚合酶活性很强, 无35 外切核酸酶活性 主要用途：修饰后用于测序5. Taq酶 耐热(75-80 C)的DNA聚合酶专用于PCR6.逆转录酶： AWV (源于鸟成髓细胞白血病病毒)， Mo-MLV(源于Moloney鼠白血病病毒) 活性： (1)53 聚合酶活性 (2) RNaseH活性(Mo-MLV 小,cDNA得率高) 主要用途： (1)反转录cDNA (2) 标记5 突出端（补平） (3) 测序7.末端转移酶作用:在DNA或

9、RNA3羟基上加dNTP主要用途：(1)载体或cDNA加同聚尾(100nt) (2)DNA的3OH同位素标记三. 激酶T4多聚核苷酸激酶催化ATP的 -磷酸基到DNA或RNA的5 OH主要用途: DNA的5OH同位素标记 (寡核苷酸)四四. .连接酶连接酶 T4 DNA连接酶 连接：粘端，平端，dsDNA中的切口， 杂交体连接五.碱性磷酸酶 包括细菌碱性磷酸酶(BAP)和小肠碱性磷酸酶(CIP), 虾碱性磷酸酶(SAP)用途: 去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5 磷酸根六六. .核酸酶核酸酶1.DNA1.DNA酶 为DNADNA内切核酸酶, ,水解单链或双链 用途:(1):(1)缺口平移

10、标记探针时产生随机切口 (2)(2)降解DNADNA2.RNA2.RNA酶 内切核糖核酸酶, ,专用降解RNARNA3. S1核酸酶 作用: :降解单链DNADNA或RNA(RNA(酶量小) ) 降解双链DNA(DNA(酶量大) ) 用途:(:(1)1)去除DNADNA突出端, ,切为平头 (2)(2)打开cDNAcDNA发夹结构4.4.外切核酸酶III(ExoIII)III(ExoIII)作用: :从双链 DNA3DNA3OH OH 逐一降解单核苷酸 不降解单链DNADNA或3 3突出的从双链DNADNA用途: :系列缺失亚克隆 第四章第四章 工具酶工具酶 工具酶工具酶基因工程技术中能用于D

11、NA和RNA 的合成、连接、切割和修饰的各种酶。包括：包括：限制酶,核酸酶.聚合酶, 连接酶, 激酶, 磷酸酶, 二.限制酶系统分类和命名 1985年后大量限制酶被发现，已从350多种微生物中发现2000多种限制酶，识别108种不同的特定序列限制性内切酶的分类 型: 特异识别、随机切割 型：特异识别、同点切割 型：特异识别、异地切割通常所指的限制酶即类酶 四.一般限制酶的识别特点1. 大多数是严格的识别顺序，少数可变2. 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长3. 多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位 点在切割位点之外，具旋转对称性四四. .连接酶连接酶 T4 DNA连接酶 连接：粘端，平端，dsDNA中的切口， 杂交体连接五.碱性磷酸酶 包括细菌碱性磷酸酶(BAP)和小肠碱性磷酸酶(CIP), 虾碱性磷酸酶(SAP)用途: 去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5 磷酸根四四. .连接酶连接酶 T4 DNA连接酶 连接：粘端，平端，dsDNA中的切口， 杂交体连接五.碱性磷酸酶 包括细菌