蛋白质工程学考试复习ppt课件

1、一、蛋白质工程的概念一、蛋白质工程的概念工程化：理念设计制造功能实现工程化：理念设计制造功能实现 以蛋白质分子的构造规律及其生物功以蛋白质分子的构造规律及其生物功能的关系作为根底，经过化学、物理和分子生能的关系作为根底，经过化学、物理和分子生物学的手段进展基因修饰或基因合成，对现有物学的手段进展基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进展改造，或制造一种新的蛋白质，以蛋白质进展改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对消费和生活的需求。满足人类对消费和生活的需求。；蛋白质工程产生的标志蛋白质工程产生的标志19821982年，年，WinterWinter等初次等初次报道了经过定点诱变获报道了经过定点诱变获

2、得改性的酪氨酸得改性的酪氨酸tRNAtRNA合合成酶成酶(Nature,299,1982)(Nature,299,1982)l19831983年，年，UlmerUlmer首先提出了首先提出了“Protein Engineering“Protein Engineering的的概念概念Science, 1983Science, 1983，219: 219: 666-671666-671 The prospects for protein engineering, including the roles of x-ray crystallography, chemical synthesis of

3、DNA, and computer modelling of protein structure and folding , are discussed. -Deliberate design and production of proteins with novel or altered structure and properties, that are not found in natural proteins.；三、蛋白质工程的研讨内容三、蛋白质工程的研讨内容 以蛋白质分以蛋白质分子的构造规律及其生物功子的构造规律及其生物功能的关系作为根底，经过能的关系作为根底，经过化学、物理和分子生

4、物学化学、物理和分子生物学的手段进展基因修饰或基的手段进展基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进因合成，对现有蛋白质进展改造，或制造一种新的展改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对消蛋白质，以满足人类对消费和生活的需求。费和生活的需求。1. 1. 蛋白质构造分析蛋白质构造分析& &功能研讨功能研讨 根底关系学根底关系学2. 2. 构造、功能的设计和预构造、功能的设计和预测测 根底的运用与验根底的运用与验证实验科学证实验科学3. 3. 发明和发明和/ /或改造蛋白质或改造蛋白质 终目的工程学终目的工程学；定点突变等遗传操作技术定点突变等遗传操作技术蛋白质构造解析技术蛋白质构造解析技

5、术生物信息学分析技术生物信息学分析技术蛋白质的设计、表达、消费技术蛋白质的设计、表达、消费技术；如何认识蛋白质？蛋白质家族family一组进化上相关的蛋白质，这些蛋白质共享一个或多个构造域 蛋白质的物理性质等电点、分子量、沉降系数、分子半径、跨膜区构造域等 蛋白质的细胞定位在细胞中定位cellular component 蛋白质的生物功能哪个生化过程中起作用biological process，起怎样的分子功能molecular function ；L-L-型的氨基酸型的氨基酸构型configuration：一个分子中原子的特定空间排布L-型的单一手性分子构型转化时必需有共价键的断裂和重新构成

6、不同构型分子除镜面操作外不能以任何方式重合化学上可以分别，不可由单键旋转相互转换；构象conformation：组成分子的原子或基团绕单键旋转而构成的不同空间排布构象转化时不需求共价键的断裂和重新构成化学上难以区分和分别；1.-螺旋螺旋 构造构造-helixn多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，构成螺旋构造多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，构成螺旋构造.莱纳斯莱纳斯卡尔卡尔鲍林鲍林肽链内构成氢键，氢键的取向几乎与轴平行。肽链内构成氢键，氢键的取向几乎与轴平行。中心无空腔。中心无空腔。 稳定稳定蛋白质分子为右手蛋白质分子为右手- -螺旋。螺旋。 ；折叠的构造特点折叠的构造特点 n氢键是在片层间

7、而不是片层内构成。；在平行在平行a和反平行和反平行b折叠片中氢键的陈列折叠片中氢键的陈列平行式构象：平行式构象：= -119O= -119O， = = 113O113O反平行式：反平行式：= -O= -O， = = O O；3.3.转角转角turn)turn)3.1转角(-turn)由四个AA组成;第一个AA的 -C=O 和第四个AA的 N-H 之间构成氢键一个不很稳定的环状构造。 3.2转角(-turn)由3个AA构成的转角；四、维系蛋白质构造的作用力四、维系蛋白质构造的作用力肽键肽键 二硫键二硫键氢键氢键离子键离子键金属离子配位金属离子配位键键疏水键疏水键 范德华力范德华力；第二遗传密码现

8、有的遗传密码仅有从核酸序列到无构造的多肽链的信息传送，因此是不完好的。无构造的多肽链到有完好构造的功能蛋白质信息传送部分遗传密码的第二部分，即蛋白质中氨基酸序列与其三维构造的对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密码；3.第二遗传密码的特点简并性氨基酸序列不同的肽链可以有极为类似甚至一样的三维构造。多意性一样的氨基酸序列可以在不同的条件下决议不同的三维构造。全局性和复杂性在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此接近而相互作用，并对分子总体构造产生重要影响；后构成的肽段可以影响曾经构成的肽段的构象从而呵斥对分子整体的影响等。；一、蛋白质和新生肽链折叠新生肽链的折叠 不仅指肽链在空间的盘旋卷曲，而是包括

9、广义的新生肽链的整个成熟过程，包括化学修饰、跨膜转运、亚基组装、水解激活等。蛋白质的折叠(protein folding) 从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维构造的活性蛋白质的过程。；3.体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠的区别完好肽链在试管内的重折叠相当于翻译完成后才折叠，与新生肽链的合成延伸与折叠同时进展不同。细胞内新生肽链折叠是一个比蛋白质体外重折叠快得多的过程。温度、浓度、pH值不同细胞和试管另一个重要差别是“大分子拥堵问题。；三、协助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子分子伴侣 molecular chaperone折叠酶：催化与折叠直接有关的化学

10、反响的酶。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl prolyl cis-trans isomerase, PPI)；molecular chaperoneA large and diverse group of unrelated proteins that all share the functional property of assisting the noncovalent assembly and/or disassembly of protein containing structures in

11、vivo, but are not permanent components of these structures when they are performing their normal biological functions.一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是协助其他含蛋白质的构造在体内进展非共价的组装和卸装，但不是这些构造在发扬其正常的生物学功能时的永久组成部分。；分子伴侣的定义完全是功能上的。分子伴侣与酶的异同点一样点参与促进一个反响而本身并不在最终产物中出现不同点分子伴侣对靶蛋白不具有高度专注性分子伴侣的催化效率很低分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进

12、其正确折叠。1.2分子伴侣与酶的异同点；1.3分子伴侣在蛋白质分子折叠中的作用分子伴侣首先会识别折叠过程中构成的折叠中间物的非天然构象，而不会去理睬天然构象。与这些中间物结合，生成复合物，防止过早的或者错误的相互作用而阻止不正确的无效的折叠途径，抑制不可逆的聚合物的产生，促进折叠向正确的有效的途径进展。分子伴侣与早期构成的中间物相互作用而防止它们之间的聚合。；由分子伴侣和靠耗费三磷酸腺苷的能量而发扬作用的特定的蛋白水解酶组成。 分子伴侣协助新生肽正确折叠；而特定的蛋白水解酶把不能继续正确折叠的或错误折叠的“渣滓水解成小分子。 ；分诊治疗机制triage 如何“诊断和区分什么样的新生肽“病人可以

13、送到分子伴侣“病房进展治疗和挽救，而什么样的新生肽“病人已“无可救药，只能送给蛋白水解酶去处置。细胞内新生肽“病人的命运主要是由分子伴侣处置“病人的才干和速度在动力学上来决议的。 ；1.熵判据和蛋白质折叠未折叠的形状包含很多具有不同构象的分子。；2.吉布斯自在能判据和蛋白质折叠吉布斯自在能判据和蛋白质折叠G= H- TS；1.The Levinthal Paradox当蛋白折叠是构象搜索时，将会有太多的构象需求尝试。仅仅思索蛋白的主链，每个残基在未折叠时假设只需3个构象，对一个有100AA的多肽来说将有 3100 构象。假设构象搜索的速度是 1012 构象/s，需求5 x 1035 s (1.

14、6 x 1028 y)蛋白质折叠不是随机的，而是有捷径的。；常见常见“折叠病折叠病老年性痴呆症(Alzheimer syndrome)病人脑中充溢了由错误折叠蛋白构成的杂乱的蛋白质簇。主要分为两类：含有沉淀样蛋白A 的沉淀样斑，tau蛋白引起的神经细胞内自损伤。帕金森氏症Parkinson disease主要是由于蛋白质的错误折叠，病人随意运动的控制才干逐渐丧失，由于能产生多巴胺的神经细胞逐渐被破坏，其缘由和发活力制尚不清楚。某些肿瘤抑癌基因突变呵斥抑癌基因编码的蛋白质稳定性改动引起的一些癌症的发生。p53稳定性的降低导致癌症的发生。；2 2设计层次分类设计层次分类基于天然蛋白质构造的分子设计

15、“小改：定位突变和化学修饰“中改：构造域进展拼接组装全新蛋白质设计“大改完全从头设计全新的蛋白质 Knowledge-based approach cycle；1甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸分子量都比较小灵敏性 GlyAlaPro甘氨酸具有高度柔韧性，可在螺旋、 折叠处出现，但更常见于铰链区或 转角。Gly在定点突变时，普通不宜随意改动Pro比较刚性，常出如今转角Ala处于二者之间，常用作取代别的氨基酸的首选。Pro和Gly是螺旋的中断者；MethodsSpecificOld specificDNA shuffling Cassette mutugenesisNew specificOligo-di

16、rected site mutagenesisPCR based site mutagenesisUnspecificOld unspecificUVX-rayOther chemicalNew unspecifictransposonsdegenerated primers；transposons转座子:细胞中能改动本身位置的一段 DNA会跳舞的基因从染色体的一个位置跳到另一位置，从一个染色体跳到另一染色体。 ； Oligo-directed site mutagenesis ssDNA (M13 method) and dsDNA Kunkel method DpnI method Ant

17、ibiotic resistance RE-site ；2.Crossover PCR重叠延伸PCR的原理为采器具有互补末端的引物，使PCR产物构成重叠链，从而在随后的扩增反响中经过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。该方法首先在特定的待突变位点和上下游分别设计引物，引物A、B为上下游引物，且分别与模板链互补，引物C、D为突变引物。先以引物B、C进展PCR，得产物BC，再以引物A、D进展PCR得AD，混合扩增产物，以A、B为引物进展扩增，可得到具有突变位点的DNA片段。 ； Gene fusion and gene link；Methods of Gene fusion and g

18、ene linkMethods of Gene fusion and gene linkVia REVia REVia silent mutation creat unique REVia silent mutation creat unique REVia crossover PCRVia crossover PCRVia inteinVia intein；tRNA-mediated protein engineering Incorporation of non-natural amino acids into proteins；蛋白质化学修饰的意义改动蛋白质的药代动力学调解蛋白质的稳定性

19、以及活性改动蛋白质的空间构象荧光标志靶点成像与临床检测；概念凡是经过化学基团或离子的引入或除去，而使蛋白质共价构造发生改动，都可以称为蛋白质的化学修饰侧链基团的改动化学修饰的范畴主链构造的改动分子生物学基因重组和定点突变；体外聚乙二醇修饰PEG化(1)增大药物分子量，防止被肾小球过滤(2)妨碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)添加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物 +蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH；试剂特点：具有氧化性或复原性。试剂特点：具有氧化性或复原性。氧化剂：氧化剂：H2O2 H2O2 ，N-N-溴代琥珀酰亚胺

20、溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基TrpTrp、咪唑基、酚基等。、咪唑基、酚基等。复原剂：复原剂：2 2巯基乙醇、二硫苏糖醇巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)(DTT)等。等。可被复原的侧链基团：二硫键。可被复原的侧链基团：二硫键。3)氧化/复原反响；1 1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适宜表达蛋白的种类也不一样。由于各种生物的特性不同，适宜表达蛋白的种类也不一样。 2 2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同

21、，分为原核、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核细菌表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表细菌表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。经过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。经过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。 3 3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。助成分。比如昆虫比如昆虫- -杆状病毒表达体系中的杆状病毒。杆状病毒表达体系中的杆状病毒。蛋白质的表达系统蛋白质的表达系统40；关于

22、表达载体的一些分子生物学概念关于表达载体的一些分子生物学概念n启动子启动子(promoter, P)(promoter, P)是指能被是指能被RNARNA聚合酶识别、聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段结合并启动基因转录的一段DNADNA序列。序列。n-10-10区区pribnow boxpribnow box和和 -35 -35区组成区组成n分类分类n转录方式转录方式n组成型组成型n诱导型诱导型n强弱强弱n取决于取决于-35-35区和区和-10-10区的碱基组成及其间隔序列。区的碱基组成及其间隔序列。 41； T7 T7 噬菌体编码的噬菌体编码的 T7 RNA T7 RNA 聚合酶选择性的激

23、活聚合酶选择性的激活 T7 T7 噬菌噬菌体启动子的转录。体启动子的转录。 T7 RNA T7 RNA 聚合酶活性高，其合成聚合酶活性高，其合成 RNA RNA 的速度比大肠杆菌的速度比大肠杆菌 RNA RNA 聚合酶快聚合酶快 5 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA RNA聚合酶有效转录的序列。聚合酶有效转录的序列。 在细胞中存在在细胞中存在 T7 RNA T7 RNA聚合酶和聚合酶和 T7 T7噬茵体启动子的情形下，噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 T7 噬菌体转录体系，噬菌体转

24、录体系，最终受最终受 T7 T7噬菌体启动子控制的基因的转录到达很高的程度。噬菌体启动子控制的基因的转录到达很高的程度。T7 表达系统表达系统42；核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率亲密相关。 大肠杆菌细胞中构造不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的构造序列所决议，称为核糖体结合位点RBS 概念概念-核糖体结合位点核糖体结合位点43；选择适宜的载体选择适宜的载体载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。载体大致可分为两大类：转录

25、载体和翻译载体。转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起起始密码子的目的基因。只需始密码子的目的基因。只需3种转录载体：种转录载体：pET-21(+)、pET-24(+)和和pET-23(+)。翻译载体包括来自翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因选择适宜的载体需求思索的要素：选择适宜的载体需求思索的要素：目的蛋白的运用目的蛋白的运用目的蛋白知特定信息目的蛋白知特定信息克隆战略克隆战略44；蛋白

26、纯化方法蛋白纯化方法类别类别 分别原理分别原理 基质或载体基质或载体凝胶层析凝胶层析 分子筛的排阻效应分子筛的排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反响离子基团的交换反响 离子交换树离子交换树脂脂 、纤维素、纤维素、 葡聚糖葡聚糖吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝 、羟基磷酸羟基磷酸亲和层析亲和层析 分别物与配体之间有分别物与配体之间有 带配基的带配基的sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex疏水相互作用层析疏水相互作用层析 疏水性差别疏水性差别 琼脂糖琼脂糖45；蛋白质三维构造解析蛋

27、白质三维构造解析2021-10-09；蛋白质三维构造测定方法及数量；X射线衍射的获得波长范围：1000.1埃欲察看其衍射景象那么衍射线度应与其波长差不多，晶体的晶格常数恰是这样的线度；晶胞晶胞(Unit cell)(Unit cell)空间点阵的单位大小和外形完全一样的平行六空间点阵的单位大小和外形完全一样的平行六面体，是晶体构造的最小单位。面体，是晶体构造的最小单位。；二、X射线晶体构造测定根本过程蛋白质获取晶体生长 X射线衍射数据搜集 构造模型的获取包括修正 tudou/programs/view/wBTB8KWJypw/；晶体的初步鉴定小分子晶体小分子晶体蛋白质晶体蛋白质晶体边界边界完整

28、，漂亮常不完整，易出现多晶硬度硬度偏硬，易碎成2瓣或几瓣偏软，易碎成粉脱水脱水不变化因脱水而变坏溶解性溶解性慢快偏光性偏光性强相对弱染色性染色性弱强漂浮性漂浮性下沉漂浮；1.定义：2.核磁共振景象nuclear magnetic resonance ，NMR是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射radio frequency, RF的物理过程。一、核磁共振原理一、核磁共振原理；二、几个重要波谱参数二、几个重要波谱参数1.1.化学势位移化学势位移 ：2.2. 在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密在有机化

29、合物中，各种氢核周围的电子云密度不同构造中不同位置共振频率有差别，即引起度不同构造中不同位置共振频率有差别，即引起共振吸收峰的位移，这种景象称为化学位移。共振吸收峰的位移，这种景象称为化学位移。3.3.来源于核外电子云的磁屏蔽效应来源于核外电子云的磁屏蔽效应4.4.大小与外加磁场强度成正比大小与外加磁场强度成正比；NOENOE与蛋白质构造信息与蛋白质构造信息是三维构造的主要实验根据可以直接反映蛋白质中质子对间的间隔2个质子间越近，NOE信号强度越大有相邻氨基酸残基，短程，NOE强相隔14个氨基酸残基，中程；以及相隔5个以上氨基酸残基的远程，NOE弱；p基因组基因组(genome = gene

30、+ chromosome):(genome = gene + chromosome):p生物体所拥有的全套染色体上的全部基因生物体所拥有的全套染色体上的全部基因p转录组转录组(transcriptome=transcript + genome):(transcriptome=transcript + genome):p一种细胞、组织或生物体完好基因组所对应的全套一种细胞、组织或生物体完好基因组所对应的全套mRNAmRNAp蛋白质组蛋白质组 Proteome ProteomePROTEins + genOME PROTEins + genOME ：p一个基因组、一种生物或一种细胞一个基因组、一种

31、生物或一种细胞/ / 组织所表达的全套蛋白质组织所表达的全套蛋白质p代谢组代谢组metabonome=metabolite+ genome metabonome=metabolite+ genome p一种细胞、组织或生物体所产生的一切代谢产物。一种细胞、组织或生物体所产生的一切代谢产物。组学；蛋白质组学Proteomics蛋白质组学蛋白质组学: :研讨细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变研讨细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学化规律的科学同基因组学一样同基因组学一样, ,蛋白质组学不是一个封锁的、概念化的、蛋白质组学不是一个封锁的、概念化的、稳定的知识体系稳定的知识体系, ,而是一个

32、领域。而是一个领域。是研讨基因组序列与基因功能之间的桥梁是研讨基因组序列与基因功能之间的桥梁；基于基于2DE的差别蛋白质组学分析技术流程的差别蛋白质组学分析技术流程:ESI-MS/MSMAIDI-TOF图像分析确定差别点差别蛋白质质谱分析数据处置与生物信息学分析数据搜索蛋白质鉴定条件A:样品条件B:样品；1.蛋白质组研讨整体技术的特点规模化规模化 通量化通量化自动化自动化；2.技术目的要求有效分别有效分别准确鉴定准确鉴定合理分析合理分析；蛋白质质谱技术蛋白质质谱技术799.01441.82084.62727.43370.24013.0Mass (m/z)1.3E+401020304050607

33、08090100% Intensity4700 Reflector Spec #1 MCBP = 1572.9, 131991571.88721889.95231946.0353869.35881797.91112582.25732761.37182197.19651876.95673619.75291811.8799855.05811156.60931960.04281707.79612102.1436945.47441381.69621320.58581593.87122383.92902603.27321493.76882315.15971232.63642535.25612678.26

34、271049.50152021.96283312.36352831.21362757.35742924.40823841.67583680.78493776.71093188.91823050.3032；质谱任务流程进样系统进样系统离子源离子源质量分析器质量分析器离子检测器离子检测器1.加热进样2.直接进样1. 离子阱2.飞行时间3.四极杆 三级联用4.傅里叶变化离子盘旋共振1.电子轰击 2.化学电离 3.场致电离 4.激光轰击5.快原子轰击6.电喷雾离子化7.基质辅助激光解吸附电离MALDI8.外表加强激光解析电离SELDI；MALDIMALDI的原理是用激光照射样品与基质构成的共结晶的原理是用激光照射样品与基质构成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传送给生物分子，而电薄膜，基质从激光中吸收能量传送给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到