AgilentHPLC仪器组成及基本操作步骤

1、1 Agilent 1200 HPLC Agilent 1200 HPLC 仪器组成及基本操作步骤 Agilent 1200 HPLC Agilent 1200 HPLC 结构图 高效液相色谱法（HPLCHPLC：是在经典液相色谱法的基础上，以高压输 送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器， 发展而成的现代液相 色谱分析方法。它具有分离效率高、选择性好、分析速度快、检测灵 敏度高、操作白动化和应用范围广的特点。 一. 溶剂瓶装置 溶剂 使用棕色玻璃瓶会避免藻类的生长； 所用的水为重蒸水；溶剂选用色 谱纯，使用前要用 0.22 v m0.22 v m 的过滤膜过滤；使用新鲜配制的流动相， 特别

2、是水溶剂或盐缓冲液，建议不超过两天；避免溶剂瓶暴露在直射 阳光1.溶剂（流动相）一 真空脱气机 3、手动进样器 4、柱温箱 2,输液系统 （四元泵） 2 下。 避免使用下述可腐蚀钢铁的溶剂： 碱金属卤化物及其酸溶液 （如：碘化锂、氯化钾等） ；高浓度无机酸， 如硝酸、硫酸；可能含有过氧化物的色谱醇酬 （如 THFTHF 二氧六环、 二丙基乙酬）。这些在 使用前必须用干燥氧化铝过滤除去过氧化物； 含强络合剂的溶液（如 EDTAEDTA 乙二胺四乙酸）；四氯化碳与 2 2- -异丙醇 或四氢味喃的混合液。 二. 在线脱气装置3 溶用RK箱 输出毛蜩官至自动谜样器(G1312-67306) MCCV

3、 波纹康褊管的掖头【5。死”4孙，再订购包装，5浦 在线脱气机工作原理 4 总览（只痴四个梆通道中的一个） 真空箱 四元泵真空脱气机由一个四通道（有四个管状塑料膜）真空箱和一个 真空泵构成。打开真空脱气机的电源开关后，控制电路即开启真空泵， 真空泵运行使真空箱内产生部分真空。 真空度由压力传感测定，根据 传感器信号，真空脱气机通过运行或关闭真空泵来维持真空度。 溶剂瓶中的溶剂在 LCLC 泵的抽动下流过真空箱内的特殊管状塑料膜。 当溶剂经过真空管时，溶剂中溶解的气体将渗透过塑料膜进入真空 箱，到达真空脱气机出口时，溶剂几乎被完全脱气而不含有任何气体。 三. Agilent 1200 Agile

4、nt 1200 四元泵5 6 四鬲蹒 1 2 3 4 当盐溶液和有机溶剂混合时，盐溶液可能与有机溶剂完全混溶， 而不 会出现沉淀。但是在梯度阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来。 通常，阀的 A A 通道用于水相/ /盐溶液，而泵的 B B 通道用于有机溶剂。 如果使用的是这样的配置，盐将落回到盐溶液中，并被溶解。 A: A: 水相 B:B:甲醇 C:C:乙腊 D:D:缓冲盐 当泵头安装有冲洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这样就会增 加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要打开 sealseal- -wash,wash,用 10% 10% 异丙醇冲洗泵。 10% 10%异丙醇有助于降低水的表面

5、张力， 并有抑菌作用。不要用其它 溶剂代替。 7 四. 手动进样器 先使阀处于装样(load )load )位置，用微量注射器将试样注入贮样管 (sampling loop (sampling loop )。进样时，转动阀芯至进样(injection injection )位置， 贮样管内的试样由流动相带入色谱柱。定量环为 20 v l20 v l。 五. 检测器 按其适用范围检测器可分为通用型和专属型两大类。 专属型检测器只能检测某些组分的某一性质， 如紫外检测器和荧光 检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。 通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质，如示差折光和蒸发 光散射检测

6、器。 紫外检测器的工作原理是朗伯-比尔定律。紫外检测器包括固定波长、 可变波长和光电二极管阵列检测器。 可变波长紫外检测器一般采用免灯为光源，能够按需要选择组分的最 大吸收波长为检测波长，从而提高灵敏度。 基本操作步骤 实验前准备 明确实验目的和检测样品的性质，选择相应的分析 色谱柱； 配制分析的样品和流动相，选用色谱纯流动相或用 0.220.22诉诉m m 的过 滤膜过滤(进口甲醇和乙腊不用过滤) ； 检验仪器和计算机的电源线，数据线是否连接完好。 开机 8 将所用的通路小心放入试剂瓶中（防止滤头破裂），色谱柱按流速 的方向装好，要拧紧并在柱头和柱尾的下面垫上滤纸； 先打开总电源的开关，然后

7、打开计算机的电源，待计算机运行稳定； 从上到下依次打开脱气机、泵、柱温箱、检测器的电源开关； 待仪器白检完成后，双击桌面上的“联机”图标，打开工作站（如 图一所示） 设定参数 更改样品信息：单击运行控制下的样品信息弹出对话框 （如图二所 示），更改操作者姓名、子目录和所存储的文件的文件名。 设置试剂瓶的填充量：单击界面上的试剂瓶的图标，设定溶剂的体 积（如图三所示） 启动各个模块：点击启动泵、柱温箱的快捷键，启动泵和柱温箱， 等柱压稳定后才能启动检测器。 设置柱温箱： 在图标上点击鼠标右键，单击设置柱温箱出现对话 框（如图四所示）然后设置实验所需要的柱温。 脱气：单击泵的图标，点击设置泵，弹出

8、对话框（如图五所示） 先将阀旋开 1212 圈，设置流速为 5ml/min,5ml/min,含量为 100100 睬次 purgepurge 各 个管路，一般先purgepurge水相再purgepurge有机相。每个管路purge 35purge 35分 钟，purgepurge时一定要认真检查滤头和管路中是否残留有气泡。 Purge Purge 完后，将流速设为 1ml/min1ml/min，并迅速将阀拧紧，用 100100 掰醇或乙腊冲 洗柱子，待柱压稳定后可以打开检测器。 单击检测器的图标，然后单击设置 VWVW 晡号可出现对话框（如图六 所9 示），可以设置所用的波长。 注意：若流动

9、相里有缓冲盐就先用 100100 用醇或乙腊冲洗柱子半个小 时然后还要用 9595 咖和 5%5%屯甲醇或纯乙腊冲洗柱子最少 1515 分钟，然 后再用你所需要的流动相比例走基线。基线稳定后就可以进样分析。 在对话框中可以设置梯度洗脱（如图八所示） 数据分析：双击桌面上的脱机图标，出现对话框然后单击文件夹图 标（如图九所示） 关机 样品分析完后，用 100100 用醇或乙腊冲洗柱子最少半个小时。如果 流动相里有缓冲盐要先用 9595 咖和 5%5%屯甲醇或乙腊冲柱子半个小时， 然后再用 100%?100%?醇或乙腊冲洗柱子半个小时。 冲洗完后，将流速设为 0ml/min,0ml/min,将水相

10、中的滤头放入有机相中， 将阀打开，设流速设为 5ml/min5ml/min，含量为 100% purge100% purge 水相的管路。 若用的有缓冲盐，要先将滤头放入纯水中 purge35purge35 分钟，然后再放 入有机相中 purge35purge35 分钟。各个管路 purgepurge 完后，将阀拧紧。 依次关闭界面上的泵、柱温箱和检测器。关闭联机和脱机的界面， 然后关闭计算机。 从下到上依次关闭仪器的各个模块的电源开关，然后换下色谱柱。 关闭总电源。 注意事项： 配制流动相所用的水要为重蒸水，新鲜配制，使用前要用 0.220.22诉诉 m m的过滤膜过滤。要用色谱级的有机试剂

11、。 10 有机系和水系的滤膜要分开，有机系的滤膜也可以过滤水系，但是 水系的滤膜不能过滤有机系，有机相会腐蚀滤膜。 供试品一定要用 0.45 v m0.45 v m 的滤头过滤，否则会引起进样阀阻塞。 泵启动前要开启 sealseal- -washwash，用 1010 得丙醇冲洗泵。设流速为一分 钟三滴，若流动相中含有缓冲盐，设流速为三秒钟一滴。 流动相使用前要进行脱气，脱气前一定要将阀打开 1212 圈，purgepurge 时要仔细检查滤头和管路中是否有气泡，脱气完后将流速设为 1ml/min1ml/min 后，迅速将阀拧紧（不要拧的过紧）。注意观察压力，若压 力大于 10bar,10b

12、ar,要与管理员联系。 一定要将柱头和柱尾拧紧，防止漏液。如果漏液，将流速设为 0ml/min0ml/min，然后再将柱子装好。用 100100 用醇或乙腊冲洗柱子时，注意 观察柱压如果柱压过大，要将流速设为 0ml/min ,0ml/min ,然后检查原因，防 止将脏东西流入检测器。 为保护检测器，等柱压稳定后再开启检测器。 进样品前要修改样品信息，否则会将上一个样品的信息覆盖。 进样前后都要用甲醇清洗进样针和进样阀。 样品分析完后，为保护滤头，要将水相中的管路放入有机相中 purge35 purge35 分钟。 为什么溶剂和样品要过滤？ 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作

13、用， 消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小 颗11 粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损， 同时也 会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 为什么 HPL3HPL3 缓冲盐时要加在线 SealSeal- -washwash 选项？ HPLCHPLC 用缓冲盐时，由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象， 析出的细小盐粒非常坚硬，它附着在蓝宝石活塞杆上，随着蓝宝石活 塞杆的往复运动，容易产生划痕，并磨损密封垫，造成漏液等故障现 象。在线SealSeal- -washwash 选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。 缓冲 盐的浓度在0.1mol0.1mol 或大