BDELISPOT单细胞分析技术

1、BD ELISPOT 单细胞分析技术 BD ELISPOTBD ELISPOT应用应用 ?移植研究移植研究 疫苗开发疫苗开发 - -亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 Th0/Th1/Th2Th0/Th1/Th2细胞转换分析细胞转换分析 自体免疫研究自体免疫研究 免疫调节及免疫治疗研究免疫调节及免疫治疗研究 癌症研究癌症研究 - -肿瘤反应肿瘤反应T T细胞作用细胞作用 过敏机制探讨过敏机制探讨 IL-4 IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞因子研究与过敏机制之细胞因子研究 传染疾病研究传染疾病研究 体液

2、免疫研究体液免疫研究 B B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究研究 BD ELISPOT原理原理 ELISPOTELISPOT实验设计实验设计: : 是在是在9696微孔培养板底部披覆微孔培养板底部披覆PVDFPVDF薄膜，用来吸附特殊挑选薄膜，用来吸附特殊挑选, , 且无毒性（不含且无毒性（不含sodium azidesodium azide、内毒素、内毒素endotoxinendotoxin）的单株）的单株 抗体。静脉血抗体。静脉血PBMCPBMC经适当分离处理后分配到微孔上，再接受经适当分离处理后分配到微孔上，再接受 适当的抗原刺激，并将微孔板放置于

3、温箱中过夜培养一段时适当的抗原刺激，并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时 间。一般而言，记忆性间。一般而言，记忆性T T细胞在受抗原刺激数小时后会开始细胞在受抗原刺激数小时后会开始 分泌细胞因子，此时局部分泌细胞因子，此时局部( (在紧靠分泌细胞的周围在紧靠分泌细胞的周围) )分泌出的分泌出的 细胞因子会被细胞因子会被PVDFPVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔板中的细胞被薄膜上特异抗体捕获。微孔板中的细胞被 移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步使用生物素移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步使用生物素 （BiotinBiotin）标记的一抗来标识，其后再与辣根过氧化物酶标）标记的一抗来标识，其

4、后再与辣根过氧化物酶标 记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞 会留下约会留下约10-20mm10-20mm大小染色的斑点。大小染色的斑点。 BD ELISPOT 流程流程 BD ELISPOT 结果显示结果显示 样本孔出现颜色斑点 Usu. 1020 mm Blank controls: G1-9: 无刺激剂的细胞 H1-9: 无细胞的刺激剂 BD ELISPOT 结果分析结果分析 ?在显微镜下计数，一个斑点代表一个分泌细胞在显微镜下计数，一个斑点代表一个分泌细胞 用用Elispot Reader 进行分析对斑点自动计数，并进

5、行分析对斑点自动计数，并做出不同大小斑点的分布图，快速、精确、还能做出不同大小斑点的分布图，快速、精确、还能平衡背景信号。平衡背景信号。 软件自动计算出细胞的分泌频率软件自动计算出细胞的分泌频率 BD ELISPOT 应用文献应用文献 ?Detection of GAD65-reactive T cells in Type1 Detection of GAD65-reactive T cells in Type1 diabetes by immunoglobulin-free ELISPOT assays. diabetes by immunoglobulin-free ELISPOT ass

6、ays. Diabetes Care, 2002, 25:1390-97. Diabetes Care, 2002, 25:1390-97. immunological studies in Type 1 diabetes. Diabetes immunological studies in Type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev, 2002, 18:367-380. Metab Res Rev, 2002, 18:367-380. Antigen-Specific CD4 Memory T Cells in Healthy Antigen-Specific CD4 Memory T Cells in Healthy Individuals and HIV Patients. The Journal of Individuals and HIV Patients. The Journal of Immunology, 2000, 164: 3723Immunology, 2000, 164: 37233732. 3732. ? Cytokine detection by ELISPOT: relevance for Cytokine detection by ELISPOT: relev