分解纤维素的微生物的分离225

1、目标目标: :1 1、知道纤维素酶的种类及作用、知道纤维素酶的种类及作用2 2、初步掌握从土壤中分离出分解、初步掌握从土壤中分离出分解纤维素的微生物的实验方法纤维素的微生物的实验方法一、基础知识一、基础知识 思考：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？ 在草食性动物的消化道内，共生有分解纤维素的微生物，其产生纤维素酶而分解纤维素。 人没有分解纤维素的能力。草食性动物是怎样消化纤维素的？下列生物能分解纤维素的是（下列生物能分解纤维素的是（ ） 人人 兔兔 牛牛 蘑菇蘑菇 纤维杆菌纤维杆菌A. B.C. D.C即：能分解即：能分

2、解纤维素纤维素的微生物有各种细菌、的微生物有各种细菌、真菌和少数放线菌，动物则为草食性动物。真菌和少数放线菌，动物则为草食性动物。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的的醋酸醋酸钠缓冲液醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，

3、放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？什么？自变量：纤维素酶的有无自变量的控制： 乙试管-1mL纤维素酶溶液 甲试管-等量的缓冲液(不能加蒸馏水，会影响溶液的pH)。实验分析：实验分析：P P2727的小实验是如何构成对照？的小实验是如何构成对照？（二）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法是_。该方法可以通过_反应直接筛选。刚果红染色法颜色2 2、其原理是：刚果红可以与纤维、其原

4、理是：刚果红可以与纤维素形成素形成_，当纤维素，当纤维素被被_分解后，红色复合物分解后，红色复合物无法形成，出现以无法形成，出现以_为中心的为中心的_，我们可以通，我们可以通过过_来筛选纤维素分来筛选纤维素分解菌。解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈练一练：练一练：1.1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是下列关于纤维素酶的说法，错误的是A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于

5、去掉植物的细胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是菌，下列说法错误的是A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落 生

6、物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。将将滤纸滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深将滤纸埋于深约约10cm10cm左右的土壤中左右的土壤中。 培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要营养物质提供主要营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g ，Na2HPO47H2O 1.2gK

7、H2PO4 0.9g， MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、生长因子、碳源、氮源氮源水解酪素水解酪素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水提示：可用提示：可用培养基与之对照培养基与之对照, ,或者将或者将。本实验的流程与课题本实验的流程与课题2 2中的实验流程有哪些异同？中的实验流程有哪些异同？ 课题课题2 2是将土样制成的是将土样制成的菌悬液菌悬液直直接涂布接涂布在以尿素为唯一氮源的在以尿素为唯一氮源的选择性选择性培养基培养基上，上，直接分离直接分离得到菌落。得到菌落。 本课题本课题通过通过选

8、择培养选择培养，使纤维素，使纤维素分解菌得到分解菌得到增殖增殖后后，再再将菌液将菌液涂布涂布在在鉴别培养基鉴别培养基上上。其他步骤基本一致。其他步骤基本一致。 思考：思考：比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌培养在只有将细菌培养在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养，增加浓度选择培养，增加浓度

9、101102103104105106培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸上述物质溶解后，加蒸馏水定容至馏水定容至1000mL水水鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考： 漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现

10、的透明圈不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。不够清晰。比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤

11、维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有红色的观察菌落周围是否有红色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中

12、没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。 2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。等不同的分离结果。 为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行为了确定分离得到的是纤

13、维素分解菌，还需要进行_实实验，纤维素酶的发酵方法有验，纤维素酶的发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤维素酶测定方法是对发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 五、课题延伸五、课题延伸分解纤维素的微生物的分离纤维素酶种类、作用、催化活力刚果红染色筛选原理实验设计土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌课堂总结课堂总结练一练练一练1、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生

14、物、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（学观点？（ ）A、生物结构与功能相适应的观点、生物结构与功能相适应的观点 B、生物结构与功能整体性观点、生物结构与功能整体性观点C、生物与环境相适应的观点、生物与环境相适应的观点 D、生物发展进化的观点、生物发展进化的观点2、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（ ） 土壤取样土壤取样 梯度稀释梯度稀释 选择培养选择培养 菌悬液涂布平板菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落挑选出单个菌落A、 B、C、 D、3、有关选择培养正确的叙述是（、有关选择培养正确的叙述是（ ）A、可以增加纤维素分解菌的浓度、

15、可以增加纤维素分解菌的浓度B、可以减少纤维素分解菌的浓度、可以减少纤维素分解菌的浓度C、所用培养基是固体培养基、所用培养基是固体培养基D、所用培养基是平板培养基、所用培养基是平板培养基CBA1111年年39.39.【生物生物 选修选修1 1：生物技术实践（：生物技术实践（1515分）分）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：效降解原油的菌株。回答问题：在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一

16、碳源的固体培养基上，为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于从功能上讲，该培养基属于 培养基。培养基。纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即方法有两种，即 和和 。 石油石油选择选择平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力 。通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用的灭菌方法有的灭菌方法有 、 和和 。无菌技术要求试验操作应在酒

17、精灯无菌技术要求试验操作应在酒精灯 附近附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。进行，以避免周围环境中微生物的污染。强强灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌法干热灭菌法高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法火焰火焰 采用新鲜牛肉经剔除脂肪、消化、过滤、采用新鲜牛肉经剔除脂肪、消化、过滤、浓缩得到的一种棕黄色至棕褐色膏状物。有浓缩得到的一种棕黄色至棕褐色膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。 牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。广泛

18、应用于生物及维生素类的水溶性物质。广泛应用于生物制药发酵及各种培养基的制备。制药发酵及各种培养基的制备。 在当中它起的主要作用是补充蛋白胨以在当中它起的主要作用是补充蛋白胨以及其它氮源的营养不足。一般的用量为及其它氮源的营养不足。一般的用量为0.3%0.3%0.5%0.5%。1 1、牛肉膏、牛肉膏2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是菌，下列说法错误的是A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄

19、糖形成红色复合物D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌101102103104105106比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成