pMD18-T使用说明书(附序列)

1、TaKaRa Code： D101ApMD®T VectorTaKaRa宝生物工程（大连）有限公司内容Page制品说明1制品内容1保存1纯度1用途1 pMD®18-T Vector的结构1实验操作2Control DNA片段的克隆实验2一般DNA片段的克隆实验2相关说明3使用注意4 Q&A制品说明pMD®18T Vector是一种高效克RfcPCR户物(TA Cloning)的专用裁体本載体由pUC18 «体改建而成, 在PUC18戏体的多克隆位点处的刃皿I和如1识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用尿oR V进行壽切 反应后，再在两侧的3,

2、靖漳加 T 而成.因大部分耐热性DNAM合II进行PCR反应时都有在PCR产物 的3,末靖澱加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效車.由于本栽体以pUC18第体为基础构建而成，所以它具有同pUC18箴体相同的功能。此外，本创品中的高 效连接液Solution I可以在短时间内(约30分钟)完成连接反应，其连接液可以直接用于细茵转化，大 大方便了实验操作.本制品中的Control Insert (500 bp)还可以用于Control反应.制品内容pMD®18-T Vector (50 ng/pl)20glxl 支Control Insert (50 n

3、g/il)10glxl 支Solution I*75glX2 支*使用时请于冰中融解.保存：209纯度 Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA R段.用途进行TA克隆，克隆PCR产物。对克It后的PCR严物使用BcaBEST Sequencing Primers M13 Primers进行DNAJR)序. pMD®18-T Vector的结构Hind IIISphlSse8387 IPstlHlnc 11Acc IMlFcoR v T-Cloning SiteXbal8>mH ISmt IXm« IKpnlSclSerf

4、 EST11* Sequencing Primer RVMGAGCGGATAACAATTTCACACAGG gcZEcoR I Sac I Kpn IXm«lflamHI XbeHlnc llAccI Sie«3«7 ISph Hl" 111Far I GAGCGaATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAaCTCGGTACCCGQGGATCCTCTAQAGATATCGTCGACCTGCAQQCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCQTGACTGGGAAAACCCTG

5、GCG 3*CAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCBcaBEST讥 Sequencing Primer M13-47Digested by EcoR VtctagagatTagatctcta tcgtcgacc Ttagcagctgg -(T-Cloning Site)EcoR IpMD®18-T Vector相关位点说明】Cloning 8辻 e425BcaBEST Sequencing Primer M13-47 binding site352-375BcaBEST Sequencing Primer RV-M binding s辻e484-507LacZ operat

6、or146-475ColEl ori873-1461Ampr1632-2492实验操作 Control DNA片段的克隆实验A）操作方法1）在微丘离心管中配制下列DNA濬戒，全为5皿。pMDr18-T Vector* 11plControl Insert*21pldH2032）加入 5 pl （等童）的 Solution I.3）16P反应30分钟.注）室温（259也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。4）全H （10 pl）加入至100MJM109燼受态细胞中，冰中SJt 30分伊5）42P加热45秒钟后，再在冰中放1分伊6）加入890pl

7、SOC培养基，379掘荡培养60分钟.7）在含有XGal、IPTG、Amp的L琼脂平板墳养基上培养，形成单苗落.计数白色、蓝色茵蒂。8）挑选白色苗落，使用PCR法确认栽体中插入斤段的长度大小。B）结果使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5X108 cfu/Mg pUC19 DNAoControl Insert连接/转化效本 (cfu/ pg Vector)白色U落比卓（）效車(%) *+1.7X10698.190以上l.ixio540.40效率是指白色菌落中的目的DNA Insert片段的连入效率.一般DNA片段的克隆实验1)在微畳离心管中

8、配制下列DNA濬液，全为5 4 pMD®18-T Vector* 11 glInsert DNA*30.1 pmol0.3 pmoldH2Oup to 5 gl2) 加入 5 pl (<Ht)的 Solution I。3) 169反应30分钟。注)室温(25也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低. 长片段PCR产物(2kbp以上)进行DNA克隆时，连接反应时间谓延长至数小时。4) 釦t (10 pl)加入至100MJM109感受态细胞中，冰中放30分锹5) 42P加热45秒钟民 再在冰中放分钟.6) 加入890 pl SOC培

9、养基，379振荡培养60分钟7) 在會有XGal、IPTG、Amp的L琼脂平板培养墓上培养，形成单菌落.计数白色、蓝色WS8) 挑选白色苗落，使用PCR法确认載体中插入片段的长度大小.1 pMD®18-T Vector的使用取0.5 pl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pMD®18-T Vector 1 |il (50 ng)的尔数约为 0.03 pmol«2 Control InsertControl Insert 为 500 bp 的 3,末端带有 A 被基的 PCR 产物，Control Insert 1 pl (50 n

10、g)的豪 尔数约为0.15pmoL3 Insert DNA 的使用在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1 : 240.相关说明1. 感受态细胞的选择.转化时请使用高效的热转化赫受态细胞(转化效車A1X 108 cfu/pg PUC19),这样才可能得到比较理想 的阳性克隆。如果潘要进行蓝白筛选时，宿主细18必須具有正确的羞因型(F'编码的严生3 Fragment,才可能和假体DNA严生的a多狀相结合，表现出B 半乳糖昔酵活性(a 互补性)。2. Insert DNA 的要求Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行栽体连接，尽進免引物停其

11、它奈质的存在。切胶回 收时可使用TaKaRa凝胶回收试剂盒(TaKaRa Code: D301威DV805A)。3. Insert DNA使用的计算方法进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的康尔数比一般为1: 210,我们可以根据自己的实验情况 选择合适的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA使用的计算方法如下：Insert DNA 的使用it (ng) =nmol 数 X 660 X Insert DNA 的 bp 数本第体1 pl (50 ng)的廉尔数约为0.03 pmol.4. 阳性克隆的检測.DNA片段成功插入至pMD18 Vec

12、tor中后，一般情况下0 半乳糖昔肆的表达将受到破坏，重组克隆体 在含有XGal、IPTG、Amp的L-»J»平板培养基上培养时将显示白色苜落但有时比较短的DNA片段插 入載体时，墓因的读码框有可能正好与"旳的读码権相吻合,克騒体也会显示蓝色菌落.有报道称，2 kbp 的DNA片段插入到載体中后，重组克隆体仍显示了蓝色.所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检 测蓝色WT落进行阳性克隆检测时，我们建议使用PCR的方法，扩堆用引物可以使用购BESTE Sequencing Primers,可以对菌体直接进行PCR扩増。5. 阳性对照实验。为了确认实验操作的正确性以

13、及实验试剂的有效性,我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法，使 用试剂盒中提供的Control Insert,可以进行10次阳性对照实验。6转化效率的计算.取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100 pl的热转化感受态细胞中后，再加入900 pl的SOC培养羞 （0.1 ng DNA/ml）,将上述培养液稀释10倍后（0.01 ng DNA/ml）取100皿涂布平板（0.001 ngDNA/100比），记录菌落数.以得到200个克It体为例计算转化效車，此时的转化效*=200 cfu/0.001 ng=2 X105 cfu/ng=2 X 108 cfu/pg pUC 1

14、9 DNA使用注意1. Solution I请于冰中融解。2. 克It时使用的Insert DNA片段（PCR严物）11议进行切胶回收纯化，否则PCR严物中的短片段 DNA （善至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物第奈质都会形响TA克庫效車.3. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20小。当要转化的DNA量校大或 准备进行电转化时，需对连接液进行乙尊沉淀，纯化DNA后再进行转化.进行乙寿沉淀时使用核酸 共沉剂（TaKaRaCode： D605A）可以提高DNA的闻收車.4. 连接反应请在25P以下进行，温度升高（269）较难形成环状DNA.连接效和B低时，可适当

15、 延长连接反应时间至数小时。5. 本制fit来糠于PUC18載体，因此，适合pUC18«体的處受态细胞都可以使用，如：JM109等. Q&AQ-1怎样提高连接转化效車？A-l 1.确认Insert DNA斤段的3'末靖是否带有“A”尾。大部分的商保戛DNA豪合（如：加氓 Pyrobest. KOD. Pfx. Pfu）扩増的PCR严物是平淆末鸚不能直接进行TA克隆。2. 纯化PCR严物.豪好使用切胶间收的PCRR段，以除去PCR严物中的非特异性片段和引物等 奈质。进行切胶回收时可以使用TaKaRa凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code:D301或DV805A）.3.

16、请使用转化效率大于108 cfu/Rg PUC19 DNA的感受态细胞。4. DNAR段的立体结构、DNA片段的长短棉会形响克隆效車._般情况下，大片段DNA的克軽 «* （连接效卓与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或釆用电转化方法。5. 进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段在紫外线下鼻傅时间过长。6. Solution I应尽邀免反复冻融。7. 建议使用«rK«|的平板培养基.Q-2转化后的WS全为蓝色，但有目的DNAH-段的插入，为什么？A-2插入的DNA片段较短（小于500 bp）,且插入片段没有影响墓因的渎権，此时平板培养墓上 出现的苗落有可能呈现蓝包（或淡蓝色）。Q-3欲对克IftDNA片段进行测序时，使用何种弓|物？A-3本載体耒源于pUC18載体因就，用于pUC18載体測序的通用引物都可以使用.MEMO-3-技术咨询热线 876416868008909508, 4006518769宝生物工程(大连)