PCR的种类及应用ppt课件

1、PCRPCR的种类及应用的种类及应用 学号：21014017 王志慧 序2021-12-281 PCRPCR的历史的历史操作过程操作过程引物引物步骤步骤 PCRPCR的各种变体的各种变体PCRPCR的应用的应用鉴定基因鉴定基因亲子鉴定亲子鉴定诊断遗传病诊断遗传病克隆基因克隆基因诱变诱变分析远古分析远古DNADNA鉴定特定表型的突变体基因鉴定特定表型的突变体基因比较基因表达量比较基因表达量 目录目录2021-12-283PCRPCR这项技术是由凯利这项技术是由凯利穆利斯穆利斯(Kary Mullis)(Kary Mullis)发明，并因此在发明，并因此在七年之后，七年之后，19931993年年1

2、010月，获得了月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，的想法是，利用一种人工方法，和反复相同程序的方法，并利用和反复相同程序的方法，并利用一种特殊的酶一种特殊的酶即即DNADNA聚合酶聚合酶来扩增特定的来扩增特定的DNADNA片段。片段。PCR PCR 历史历史 2021-12-28DNA的复制 DNA DNA在复制时，双链在复制时，双链DNADNA解解旋成两股分别进行。其复制过程的复旋成两股分别进行。其复制过程的复制起点呈现叉子的形式，故称复制叉。制起点呈现叉子的形式，故称复制叉。以复制叉向前移动的方向为标准，一以复制叉向前移动的方向为

3、标准，一条模板链为条模板链为3355走向，在其上走向，在其上DNADNA能以能以5533方向连续合成，方向连续合成，称为前导链称为前导链(leading strand)(leading strand)；另一；另一条模板链为条模板链为5533走向，在其上走向，在其上DNADNA也是也是5533方向合成，但与方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的片段，最后在连成一条完整的DNADNA链，链，该链称为后随链该链称为后随链(lagging strand)(lagging s

4、trand)。2021-12-285 5353的聚合作用：不是复制染色体的聚合作用：不是复制染色体而是修补而是修补DNADNA，填补，填补DNADNA上的空隙或是切除上的空隙或是切除RNARNA引物后留下的空隙。引物后留下的空隙。3535的外切酶活性：消除在聚合作的外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。用中掺入的错误核苷酸。5353外切酶活性：切除受损伤的外切酶活性：切除受损伤的DNADNA，可用于切口平移可用于切口平移nick translation).nick translation). 大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段是完整的DNA聚合酶的一个片段，只有在53聚合酶活性和3

5、5外切酶活性，失去了53外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。 DNA聚合酶 Taq DNA Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1(Thermusaquaticus)yT1株株分离提取的分离提取的.yT.yT是是 一种嗜热真菌，能在一种嗜热真菌，能在70-7570-75生长生长. .存在于水生嗜热存在于水生嗜热菌菌(Thermus aquaticus)(Thermus aquaticus)的嗜热的嗜热DNADNA聚合酶，可在聚合酶，可在7474复制复制DNADNA，在，在9595仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以仍

6、具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNADNA为模板，延伸引物为模板，延伸引物，合成双链，合成双链DNADNA。这个酶只有。这个酶只有53DNA53DNA聚合酶活性和聚合酶活性和5353的外的外切酶活性，缺少切酶活性，缺少3535的外切酶活性。的外切酶活性。 该酶基因全长该酶基因全长24962496个碱基，编个碱基，编码码832832个氨基酸，酶蛋白分子为个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.94KDa.其比活性为其比活性为200000200000单位单位/mg.75/mg.758080时每个酶分子每秒钟时每个酶分子每秒钟可延伸约可延伸约150150个核苷个核苷 酸，酸，7070延伸延伸率大于率

7、大于6060个核苷酸个核苷酸/ /秒，秒，5555时为时为2424个核苷酸个核苷酸/ /秒秒. .温度过高温度过高(90(90以以上上) ) 或过低或过低(22)(22)都可影响都可影响Taq Taq DNADNA聚合酶的活性，该酶虽然在聚合酶的活性，该酶虽然在9090以上几乎无以上几乎无DNADNA合成，合成， 但确有但确有良好的热稳定性，在良好的热稳定性，在PCRPCR循环的高循环的高温条件下仍能保持较高的活性温条件下仍能保持较高的活性. . Taq DNA聚合酶2021-12-287 PCRPolymerase Chain Reaction） 即聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定基

8、因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增。 它可以在试管里建立反应，经过数小时之后，就能将极微量的目的基因或者某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过繁琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝，所以有人亦称为无细胞的分子克隆法。PCR的定义PCR 操作过程操作过程1、预变性、预变性Initial denaturation） 模板模板DNA完全变性完全变性对对PCR能否成功至关重要，一般能否成功至关重要，一般95加热加热3-5分钟。分钟。 2、引物退火、引物退火Primer annealing） 退火温度一般需要退火温度一般需要凭实验阅历决议。凭实验阅历决议

9、。 退火温度对退火温度对PCR的特异性有较大的特异性有较大影响。影响。 3、引物延伸、引物延伸 引物延伸一般在引物延伸一般在72进展进展Taq酶最适温酶最适温度）。度）。 延伸时间随扩增片段长短而定。延伸时间随扩增片段长短而定。 4、循环中的变性步骤、循环中的变性步骤 循环中一般循环中一般95，30秒足以使各秒足以使各种靶种靶DNA序列完全变性：序列完全变性： 变性时间过长损害酶活性，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 5、循环数、循环数 大多数大多数PCR含含25-35循环，过多易产生非特炖循环，过多易产生非特炖条带条带6、最

10、后延伸、最后延伸 在最后一个循环后，反应在在最后一个循环后，反应在72维持维持5-15分钟使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。分钟使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。引物设计设计引物可以采取以下原则：设计引物可以采取以下原则：GC所占比例为所占比例为4060两个引物的两个引物的Tm，相差小于，相差小于5，并且扩增产物的，并且扩增产物的Tm与引物的相差不超过与引物的相差不超过10。黏合温度通常比计算的最低黏合温度通常比计算的最低Tm低低5，但是要根据经验为不同条件下的，但是要根据经验为不同条件下的PCR选择不同的黏合温度。选择不同的黏合温度。内部的具有自身互补性的发卡结构不超过内部的具有

11、自身互补性的发卡结构不超过4个，其二聚体中不超过个，其二聚体中不超过8个。个。3末端尤其重要，必须不含有与其他引物互补的序列，并且要与模板完全末端尤其重要，必须不含有与其他引物互补的序列，并且要与模板完全互补。倒数第二个最好是互补。倒数第二个最好是G/CPCR的各种变体的各种变体 反向反向PCR (Inverse PCR, PCR (Inverse PCR, IPCR)IPCR) 不对称不对称PCR (asymmetric PCR (asymmetric PCR)PCR) 多重多重PCRPCR 荧光定量荧光定量PCRPCRQ-PCR)Q-PCR) 反转录反转录PCR (reverse PCR

12、(reverse transcription,RT- transcription,RT- PCR)PCR) 巢式巢式PCR (NEST PCR)PCR (NEST PCR) 递减递减PCR(Touchdown PCR(Touchdown PCR)PCR)2021-12-2810 原理：扩增引物相反方向原理：扩增引物相反方向DNADNA 序列的技术。用反向序列的技术。用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规而常规PCRPCR扩增的是已知序列的两引物之间扩增的是已知序列的两引物之间DNADNA片段片段. .实验时选择已知序列内部没有切点的

13、限制性内切酶实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段对该段DNADNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCRPCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究序进行分析研究. . 2021-12-2811已知序列已知序列未知序列未知序列反向PCR (Inverse PCR, IPCR)1. 1. 用一种在靶序列上没有用一种在靶序列上没有切点的限制性内切酶切点的限制性内切酶 消化消化大分子量的大分子量的DNA

14、DNA2. 2. 产生的大小不同的线性产生的大小不同的线性DNADNA片段群体，其中具靶片段群体，其中具靶DNADNA区段的区段的DNADNA分子长度不超过分子长度不超过2-3Kb,2-3Kb,经连接后环化成环状经连接后环化成环状分子分子3. 3. 按靶序列设计的一对向按靶序列设计的一对向外引物同靶序列外引物同靶序列5 5，-端互端互补序列退火结合，其延伸方补序列退火结合，其延伸方向如图中箭头所指向如图中箭头所指4. 4. 经经PCRPCR扩增产生的主要是扩增产生的主要是线性双链线性双链DNADNA分子，它是由分子，它是由左侧的序列和右侧序列首位左侧的序列和右侧序列首位连接而成，其接点就是限制

15、连接而成，其接点就是限制酶的识别位点酶的识别位点2021-12-2812运用：运用： 利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。 应用于染色体步移、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。局限性：局限性： 需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。 大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因

16、序列杂交。2021-12-2813 就像任何DNA一样，PCR的双链DNA产物也可以供序列测定使用。 然而，按照Sanger双脱氧末端链终止法测定DNA的核苷酸序列，最好是使用单链模版DNA。 现在已经发展出了一种专门用于制备单链DNA的技术不对称PCR技术。 这种技术，除了使用的两种引物浓度相差100倍以外，其他的方面跟常规PCR技术没有什么本质的区别。 不对称不对称PCR PCR 2021-12-2814基本原理：基本原理： PCR PCR扩增所用的两条引物中，扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只及高浓度的浓度受限制的只及高浓度的1%1%（或或2%2%）。）。 经过经过PCRPCR循环直到

17、限制循环直到限制引物耗尽之前，扩增的引物是双引物耗尽之前，扩增的引物是双链的链的DNADNA序列。而后，反应混合序列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引物，则物中的另一种高浓度的引物，则利用限制引物合成的利用限制引物合成的DNADNA链做模链做模板，继续引导板，继续引导DNADNA合成。合成。这样模板链继续再循环，由高浓这样模板链继续再循环，由高浓度的引物合成的度的引物合成的DNADNA要比限制引要比限制引物多得多，而且仍保持单链状态物多得多，而且仍保持单链状态。 2021-12-2815不对称不对称PCRPCR的原理的原理多重多重PCRPCR 一般一般PCRPCR仅应用一对引物，通过仅应用

18、一对引物，通过PCRPCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定因子等的鉴定. .多重多重PCR(multiplex PCR)PCR(multiplex PCR)，又称多重引物，又称多重引物PCRPCR或复合或复合PCRPCR，它是在，它是在同一同一PCRPCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCRPCR反应，其反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCRPCR相同相同多重多重PCRPCR的试验步骤的试验步骤 同一般的同一般的PCRPC

19、R操作相同，只是反应中所加入的是多对引物而不是一对引物。操作相同，只是反应中所加入的是多对引物而不是一对引物。1. DNA1. DNA提取：提取：DNADNA提取可以用提取可以用DNADNA提取试剂盒或实验室常用的一些提取试剂盒或实验室常用的一些DNADNA提取方法进行。提取方法进行。2. DNA2. DNA定量：用紫外分光光度计进行定量：用紫外分光光度计进行DNADNA含量测定。含量测定。3. 3. 多重多重PCRPCR扩增：反应体系可以选定为扩增：反应体系可以选定为20l20l，50l50l等，反应体系中含有：等，反应体系中含有：DNADNA模模板，板，Mg+Mg+，dNTPdNTP，Ta

20、q DNATaq DNA聚合酶，各种引物等。根据实验要求，设计合适的循环聚合酶，各种引物等。根据实验要求，设计合适的循环参数。在设计循环参数时要注意两个原则：一是退火温度要足够高。这是因为，参数。在设计循环参数时要注意两个原则：一是退火温度要足够高。这是因为，多重多重PCRPCR技术是在扩增体系中加入了多对引物同时进行扩增，这样就会由于错配而技术是在扩增体系中加入了多对引物同时进行扩增，这样就会由于错配而产生一些非特异性的扩增产物，增高退火温度，可以有效的减少非特异性扩增产产生一些非特异性的扩增产物，增高退火温度，可以有效的减少非特异性扩增产物的生成；二是循环参数要尽量少，以利于检测扩增产物。

21、多重物的生成；二是循环参数要尽量少，以利于检测扩增产物。多重PCRPCR在一个反应体在一个反应体系中同时扩增多个系中同时扩增多个DNADNA段，其扩增效率并不是完全相同的，循环参数的增加，会使段，其扩增效率并不是完全相同的，循环参数的增加，会使TaqTaq酶的消耗增加，再加上每对引物相对退火效率不同，就会使扩增产物混乱，所酶的消耗增加，再加上每对引物相对退火效率不同，就会使扩增产物混乱，所以，循环次数不宜过多。以，循环次数不宜过多。4. 4. 电泳检测及结果分析：取扩增产物电泳检测及结果分析：取扩增产物1010与与2626载样缓冲液载样缓冲液( (溴酚蓝溴酚蓝) )混匀上样，混匀上样，同时加入

22、分子量标准，经同时加入分子量标准，经2 2琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶( (含含0.5g/ml E0.5g/ml E、恒压、恒压(200-600V)(200-600V)、电、电泳泳1-21-2小时后，置凝胶于紫外检测凝胶分析仪观察结果，并拍照，记录分析结果。小时后，置凝胶于紫外检测凝胶分析仪观察结果，并拍照，记录分析结果。 多重多重PCRPCR的主要用于多种病原的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。分型鉴定。 1 1多种病原微生物的同时检多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一测或鉴定，是在同一PCR

23、PCR反应管反应管中同时加上多种病原微生物的特中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行异性引物，进行PCRPCR扩增扩增. . 2 2某些病原微生物，某些某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，突变或缺失存在多个好发部位，多重多重PCRPCR可提高其检出率并同时可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用鉴定其型别及突变等可系统应用的有的有: :乙型肝炎病毒的分型乙型肝炎病毒的分型; ;乳头乳头瘤病毒的分型瘤病毒的分型; ;单纯疱疹病毒的单纯疱疹病毒的分型分型; ;杜氏肌营养不良症的分型杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等

24、及癌基因的检测等. .运用荧光定量荧光定量PCR(Q-PCR)PCR(Q-PCR) Q-PCR：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 将模板稀释成一系列的浓度梯度进行PCR反应，用个这个结果作标准曲线，模板可以用已知浓度的样品或未知浓度的样品。用模版初始量的log值对每个稀释样品的Ct值作图，两者称递减的线性关系，称之为标准曲线。作标准曲线用来评定反应条件的优化保证样本有准确可重复的实验结果）

25、 Q-PCR Q-PCR 荧光化学方法1 1DNADNA结合燃料结合燃料SYBR SYBR Green 1Green 1） SYBR Green 1 SYBR Green 1 是荧光定是荧光定量量PCRPCR最常用的最常用的DNADNA结合燃料，结合燃料，与与dsDNAdsDNA非特异性结合。在游非特异性结合。在游离的状态下，离的状态下，SYBR Green 1SYBR Green 1发出微弱的荧光，但一旦与发出微弱的荧光，但一旦与dsDNAdsDNA结合，荧光强度增加结合，荧光强度增加10001000倍。倍。 缺乏特异性；缺乏特异性；不能用于多重反应，因为不不能用于多重反应，因为不能区分不同

26、扩增子发出的荧能区分不同扩增子发出的荧光，用于单重实验光，用于单重实验。 2 2荧光燃料标记的序列特异性寡荧光燃料标记的序列特异性寡核苷酸引物或探针核苷酸引物或探针TaqManTaqMan和分和分子信标）子信标）TaqManTaqMan实验实验 主要优点：高主要优点：高特异性、高信噪比和能进行特异性、高信噪比和能进行多重反应。多重反应。 缺陷：探针的缺陷：探针的初始成本比较高和实验设计初始成本比较高和实验设计比较繁琐。比较繁琐。 荧光报告基团的种类：荧光报告基团的种类：FAM(FAM(发绿色荧光发绿色荧光) )、HEXHEX、TAMRATAMRA、Texas Red Texas Red 和和C

27、y5Cy5等等 分子信标分子信标molecular beaconmolecular beacon是是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。的淬灭基团紧紧靠近。Q-PCRQ-PCR的应用的应用（1 1荧光定量荧光定量PCRPCR数据分析，绝对定量和相对定量。数据分析，绝对定量和相对定量。 生物学家通常对下列事情感兴趣：生物学家通常对下列事情感兴趣：a)a)给定的血样中的病毒颗给定的血样中的病毒颗粒数；粒数；b)b

28、)相当量的肿瘤组织和正常组织比，相当量的肿瘤组织和正常组织比，p53mRNAp53mRNA改变了多少倍。改变了多少倍。（2 2基因表达差异分析。基因表达差异分析。 例如：与一个生物合成途径有关的三个基因例如：与一个生物合成途径有关的三个基因A A、B B、C C），选），选择内参基因为择内参基因为-actin-actin，在两个样本，在两个样本a a、b b中的相对表达情况。中的相对表达情况。 用用TaqManTaqMan探针探针 进行多重实验扩增分析基因表达差异进行多重实验扩增分析基因表达差异（3 3基因型基因型/ /等位基因分析，例如等位基因分析，例如SNPSNP检测等检测等（4 4转基因

29、生物检测转基因生物检测 ，比如可以准确的检测食品中某一种转基，比如可以准确的检测食品中某一种转基因成分的含量。其实就是跟野生型生物相比该基因表达量因成分的含量。其实就是跟野生型生物相比该基因表达量RT-PCRRT-PCR RT-PCR有很高的敏感性，可以用来分析不同组织，或是相同组织不同发育阶段中mRNA表达状况的相关性。2021-12-2824巢式巢式PCR PCR 巢式巢式PCRPCR是一种变异的聚合酶链反应是一种变异的聚合酶链反应(PCR)(PCR)，使用两对而非一对，使用两对而非一对PCRPCR引物扩引物扩增完整的片段。第一对增完整的片段。第一对PCRPCR引物扩增片段和引物扩增片段和

30、普通普通PCRPCR相似。第二对引物称为巢式引物相似。第二对引物称为巢式引物因为他们在第一次因为他们在第一次PCRPCR扩增片段的内部扩增片段的内部结合在第一次结合在第一次PCRPCR产物内部，使得第二次产物内部，使得第二次PCRPCR扩增片断短于第一次扩增。巢式扩增片断短于第一次扩增。巢式PCRPCR的的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式对并扩增的概率极低。因此，巢式PCRPCR的扩的扩增非常特异增非常特异 。一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，体，HIVHIV，肿瘤基因等，肿瘤基因等 巢式巢式PCRPCR，可以在，可以在106106基因组背景下检测基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的但也是最容易污染的PCRPCR。Touchdown PCR 用来避免非特异性序用来避免非特异性序列的扩增列的扩增 PCR PCR中引物的黏合温度中引物的黏合温度(annealing temperature)(annealing temperature)决定了黏合的特异性，决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实