基因工程目基因分离和获得及重组基因导入中国药科大学生物工程所有

1、第四节 基因的分离和获得目标基因克隆的三大战略：1.1.利用PCRPCR技术或化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；2.2.构建感兴趣的生物个体的基因组文库或cDNAcDNA文库；3.3.利用基因差异表达获得目的基因。基因的分离和获得的常用方法一、基因分离的物理方法二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法三、cDNA文库的建立与基因的分离四、基因组文库法五、基因的化学合成六、聚合酶链反应技术（PCR）一、基因分离的物理方法 根据DNA分子的两条链存在着GC，A=T碱基配对。 如DNA分子中某段的GC碱基对含量高，则其热稳定性就高，其溶解温度（Tm）就高。这样，人们通过控制溶解温

2、度使富A=T区解链变性，而富GC区仍维持双链。当利用单链核酸酶S，酶去除解开的单链部分，得到富GC区的DNA片段 。二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法 用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上与一般基因大小相当的DNA片段（1000bp），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌（如：E.Coli）中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出你所要的基因。优点：操作简单，命中率较高。缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会漏。+三、基因文库法cDNA文库（cDNA library) 则是将某生物特定的组织器官或发育时期的全部mRNA反转录成cD

3、NA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的产物。基因组文库(Genomic library)是将某一生物基因组DNA全部克隆后获得的重组子群体的总称。基因文库(Gene library)是通过克隆的方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。构建基因文库的意义 1.通过基因文库的构建贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，保存物种遗传种质。 2.从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。 3.构建基因文库是研究基因本身的需要,如基因结构的分析、基因表达和调控的研究等。 基因组文库的类型: 质粒文库、噬菌体载体文库、粘粒文

4、库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。几个物种基因组大小及基因数目物 种基因组大小（ 10106 6bpbp）基因数目衣原体（M. M. genitaliumgenitalium）0.580.58470470大肠杆菌（E. coliE. coli）4.64.642884288酵母（S. cerevisiaeS. cerevisiae）13.513.560346034果蝇（D. D. melanogastermelanogaster）1651651360013600线虫（C.elegansC.elegans）97971909919099拟南芥（A. thalianaA. thaliana）

5、1351352550025500人（H.sapinesH.sapines）330033003500035000构建基因组文库应满足的条件 基因组文库的完备性：是从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。基因组文库的大小: 1: 1）基因组的大小； 2 2）克隆片断的长度； 3 3）从中分离特定基因的置信度。 N=1n(1N=1n(1一P)P)ln1-L/Gln1-L/G式中P P为期望概率，L L为单个重组体的DNADNA片段的长度，G G为基因组DNADNA的总长度。N N是所需要的重组体数目 例如，某一哺乳动物基因组G=3x10G=3x109 9bpbp，以17kb17kb的随

6、机片段克隆构建的文库中，使任一给定DNADNA序列达9999的概率出现，则： N Nln(1-0.99)ln(1-0.99)ln1ln1一(17x10(17x103 33x103x109 9)=8.1x10)=8.1x105 5 如果克隆片断长为20kb20kb，则N=6.5X10N=6.5X105 5果蝇的基因组约1.5X101.5X108 8bpbp，以20kb20kb克隆时，N=4X10N=4X105 5 基因组文库的构建 ( (一）基因组DNADNA的分离制备原核细胞的基因组包括其拟核的DNADNA和附加的遗传体系如质粒DNADNA，真核细胞的基因组包括其核基因组及细胞器如线粒体和叶绿

7、体的DNADNA。质量必须满足：1. 1. 结构具有相对完整性；2. 2. 尽量排除其它大分子成分的污染( (蛋白质、多糖及RNARNA等) )；3. 3. 保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及离子等。 （二）基因组DNADNA的片段化1.1.限制性内切酶对DNADNA分子的酶解两种方式：DNADNA完全酶解和DNADNA不完全酶解。DNA完全酶解人基因组DNADNA酶解琼脂糖凝胶M M：DNADNA分子markermarker；1 1：未酶解的人基因组DNADNA；2 2：Rsa IRsa I完全酶解后的DNADNAM 1 2DNADNA不完全酶解 人基因组DNADNA以Sau3AS

8、au3A酶进行的不完全酶解M M：DNADNA分子markermarker；1 1：未酶解的基因组DNADNA；2-102-10：显示酶解的程度逐步提高M12345678910用DNADNA的随机片断克隆法来：机械剪切和部分酶切1)1)随机片断的重叠性，能够沿某一克隆“步查”直至将整个染色体衔接起来（利用片段间重叠区的信息，可以将独立的重组子加以衔接，最后整个染色体的顺序连续出来：染色体步查 ）。 2)2)无须预知靶序列内部及其周围的限制酶切位点而仍能够分离DNADNA片段。 3)3)文库的规模减小。由于经过挑选而用于克隆的DNADNA片段大，形成一个哺乳动物基因组DNADNA文库所需的重组体

9、数目显著减少。DNADNA分子的物理剪切 运用识别4 4对碱基的限制性内切酶制备随机性DNADNA片断，具有了较高的随机性，但相对随机性更高的方式还是运用不依赖碱基序列的物理剪切方法。DNADNA分子的物理剪切可以采用DNADNA溶液的小孔喷射、超声波处理和高速搅拌等几种方式。 选择合适的构建基因组文库的载体： 1 1）要求有较大的克隆容量； 2 2）要求在置于宿主中扩增时有较高而均等的转化效率； 3 3）在重组子进行扩增时，扩增的机会相近； 4 4）可以较方便地进行文库的筛选。 基因组文库构建的常用载体：LambdaLambda噬菌体载体、cosmidcosmid、BACBAC及YAC YA

10、C 。（三）载体制备 替换型载体进行基因文库的构建示意图 （四）重组连接制备出的适当大小随机性基因组DNADNA与载体左臂右臂进行连接，实现左臂插入分子右臂的分子重组。构建文库时重组连接常采用相同粘性末端的连接，以 替换型载体构建基因组文库多采用BamH IBamH I酶切末端与插入外源DNA DNA Sau3A ISau3A I末端的互补连接。 （五）噬菌体离体包装： 宿主菌蛋白支架状前头部前头部A A蛋白结合在基因组共聚体的coscos位点尾部成熟噬菌体头部功能 噬菌体自组装及DNA包装过程（六）重组噬菌体转染大肠杆菌 噬菌体包装物在宿主大肠杆菌菌苔上检验效价及形成噬菌斑其他载体文库的构建

11、1.1.粘粒载体文库 2.2.酵母人工染色体文库 （yeast artificial chromosome,YACyeast artificial chromosome,YAC）: :YAC含有酵母染色体自主复制序列、着丝点(centromere)、四膜虫的端粒（telesome以及酵母选择标记基因组成的能自我复制的克隆载体。并带有大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记。 酵母选择标记基因：色氨酸合成酶基因（TRP1），组氨酸合成酶基因（HIS4），尿嘧啶合成酶基因（URA3），赭石突变校正基因（SUP4）。YAC 载体以环状的方式存在，可插入长度达100-2000kb的外源DNA。与 YAC

12、YAC 载体配套工作的宿主酵母菌带有一个赭石突变 ade ade 2 2。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 supsup4 4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade ade 2-12-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为UAGUAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAAUAA的无义突变又叫赭石突变。 细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BACBacterial Artificial Chr

13、omosomes BAC） 细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F F质粒的基础上构建的，命名为pBACspBACs，其装载量范围在50 - 300 kb50 - 300 kb之间。携带一个Cmr，严谨型复制子oriS, 解旋酶基因repE, 确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座parA, parB, parC及多克隆位点重组分子导入受体细胞 以LambdaLambda噬菌体载体和cosmidcosmid载体构建的重组分子在体外包装成噬菌体颗粒，通过感染细菌的方式将重组分子导入受体细胞。 以酵母人工染色体和细菌人工染色体载体构建的重组分子采用电激转化法将重组分子导入受体细胞。基因组文库的扩

14、增筛选 1.1.文库的扩增 lambdalambda载体的基因组文库是以噬菌斑的形式获得重组噬菌体的集合；cosmidcosmid载体的基因文库是存在于细菌中的大分子重组质粒，以独立的转化菌落形成集合； BACBAC文库也是以细菌菌落形式存在； YACYAC文库则以酵母菌形式出现。 噬菌体文库的扩增可以通过感染宿主，每一噬菌斑便是一个重组噬菌体扩增后的产物。用缓冲液将这些噬菌斑中的病毒洗脱下来，便获得了扩增后的文库。离心除出细菌碎片等杂质后，上清液加1-21-2滴氯仿，置于4 40 0C C可以保存数年。 粘粒载体、BACBAC和YACYAC文库，则对转化的菌落单独编号、扩增和保存。 2.2.

15、文库的筛选 硝酸纤维素膜或尼龙膜放射性标记探针进行文库杂交筛选染色体步移(chromosome walking) 当基因的位置已知，但没有可用的探针，只知道同一染色体上的另外一个已经克隆的基因，就可以通过染色体步移方法克隆所需的基因。其基本原理是用探针筛选文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列)作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列)是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛选文库。通过一系列的操作，得

16、到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。 其基本策略是根据已知基因片段的末端序列合成探针，反复进行基因文库的筛选，知道满足需要为止。染色体步移是一项复杂、繁琐的技术，到目前为止，步移最大的距离时200-200-250kb250kb。然而成功的报道很多，如人类的囊肿性纤维化疾病基因。cDNA文库的优越性： 1 cDNA克隆以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，例如流感病毒、脊髓灰质炎病毒和呼肠孤病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 2 cDNA基因文库的筛选比较简单易行。 3 3每一个cDNAcDNA克隆对应于一种mRNAmRNA序列，假阳性的概率就会比较低，因此阳性

17、的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因的序列。 4 4cDNAcDNA克隆可用于在细菌中表达基因的产物。 cDNA文库的构建与筛选cDNA文库的大小：cDNAcDNA基因文库大小的估算公式 N=ln(l-P)/ln(l-f)N=ln(l-P)/ln(l-f)N N为cDNAcDNA基因文库必需的克隆的数目；P P为文库中含目的基因cDNAcDNA片段的出现概率，一般情况下，期望值为99%99%；f f是某种mRNAmRNA的丰度。 mRNA逆转录酶cDNA复制双双链链c cD DN NA A载体重重组组D DN NA A分分子子受体菌含重组分子的转化菌 cDNAcD

18、NA文库的构建：1.cDNA1.cDNA文库构建的载体cDNAcDNA是由mRNAmRNA反转录获得的互补DNADNA，分子大小通常分布在0.5kb0.5kb10kb10kb间。 2. cDNA的获得a.a.分离mRNAmRNA 分离总体RNARNA：利用guanidine thiocyanateguanidine thiocyanate（异硫氰酸胍） -mercaptoethanol-mercaptoethanol（- -巯基乙醇）使核糖体解体，而染色体不发生解体，再采用苯酚- -氯仿抽提和乙醇沉淀，获得RNARNA。 利用mRNAmRNA分子的3 3端都含有一段由20-25020-250个

19、多聚腺核苷酸组成的poly(A)poly(A)尾巴将mRNAmRNA从细胞总RNARNA的混合物中分离出来。 GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库，因此为大多数人采用。与氯化铯方法比较，虽然纯度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。b. 对mRNA进行富集 已知要分离的目的基因mRNA的分子大小，通过凝胶电泳或

20、蔗糖密度梯度离心，回收与目的基因mRNA分子大小相近的mRNA。 分离未知分子大小的目的基因cDNA,则可把最初制备的总mRNA先通过蔗糖密度梯度离心或凝胶电泳，按mRNA分子大小分部回收mRNA。随后将每个分部回收的mRNA进行体外转译，并结合使用免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技木，鉴定出目的基因的蛋白质产物。再以此分部mRNA构建cDNA基因文库。通过离心和电泳的分部分离，可以使低丰度的mRNA得以富集。 细胞中的mRNA根据其在细胞中的拷贝数，可分为两大类：一类为高丰度mRNA，通常有100种左右的不同的mRNA，每种mRNA的拷贝数在1,000至10,000间；另一类为低丰度mR

21、NA，包括约10,000种mRNA每种的拷贝数在1至10间。c. cDNAc. cDNA的合成 cDNAcDNA第一链的合成是以mRNAmRNA分子为模板，在逆转录酶的作用下，利用适当的引物引导合成的。常用方法有，即oligo-(dT)oligo-(dT)引导的cDNAcDNA合成法和随机引物引导的cDNAcDNA合成法。oligo-(dT)oligo-(dT)引导的cDNAcDNA合成法是利用12-2012-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo-(dT)oligo-(dT)短片段作为引物，在逆转录酶的作用下，以mRNAmRNA为模板合成第一链cDNAcDNA，形成RNA-DNARNA-DN

22、A杂交分子。 G G G G G G G G G G G G G G d.粘性末端片断与载体的连接人工接头法克隆cDNAcDNA入 插入型载体e.离体包装获得重组噬菌体 文库的筛选： 筛选文库即指从文库克隆的群体中将特定的克隆选择出来的过程。分离基因的依据：根据目的基因的某些或某个特性来进行克隆筛选及基因分离。对于编码产物已知的目的基因： 1.1.可以根据蛋白质的氨基酸序列推导出核苷酸序列，并以该核苷酸序列作为探针进行直接的分离。2.2.可以应用特定的蛋白质抗体及蛋白质的功能测定来筛选相应的目的基因。编码产物未知的目的基因：需要用特殊的分离手段( (诸如差别显示技术、差别杂交方法等) )获得探

23、针，然后再进一步从基因文库中分离得到目的基因。运用简并探针筛选cDNAcDNA文库1.1.运用氨基酸序列信息进行cDNAcDNA文库筛选运用简并探针筛选cDNAcDNA文库运用标记抗体对cDNAcDNA文库进行筛选2.2.运用标记抗体对cDNAcDNA文库进行筛选3.3.分子探针杂交的方法，通过分子杂交后的信号，将与探针特异结合的克隆钓取出来。噬菌斑的吸印与杂交利用差别杂交方法对文库进行筛选4 . 4 . 运用PCRPCR方法进行cDNAcDNA文库筛选基因组文库与鸟枪法的不同点1、克隆的DNA片段较大（1030Kb，平均20Kb)，而鸟枪法为1000bp;2、可以覆盖宿主DNA的所有序列；3

24、、DNA片段要进行分离： 分离方法如：蔗糖密度梯度离心 凝胶电泳4、载体不同。基因组文库法为噬菌体，而鸟枪法为质粒。值得注意的是，从基因组文库所分离获得的基因序列包含有内含子，因此不能直接在原核细胞中表达，但更适合作为如转基因动物等的真核表达系统。四、基因的化学合成 随着寡核苷酸化学合成的自动化，基因的化学合成变得更经济、容易和准确。前提条件：对基因的结构序列清楚 。分为：基因片段的全化学合成 基因的化学酶促合成H HOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH基因的化学合成的优点1、可以合成细菌偏爱的密码子

25、2、可以定向改变个别氨基酸3、可以在两端加上需要的限制酶切点4、可以通过自动化仪器合成五、聚合酶链反应技术（PCRPCR）定义：聚合酶链反应技术是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物，以单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化，合成DNA互补链达到基因扩增目的的过程。 PCR技术反应周期包括三个步骤：1、高温变性：通过加热使得复制双螺旋DNA变性分 离为单链，作为模板。（91，1分钟）。2、低温退火：（约50，1分钟）使专门设计的一 对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模 板DNA两端的互补区段互补结合。3、适温延伸：将反应混合物的温度上升到72， 保温1分钟。 PCR原

26、理图 PCR反应的必要条件反应的必要条件： 须知基因两端的部分序列PCR反应中的几个关键因素1、Taq DNA聚合酶 2、引物的长度3、模板 4、Mg浓度5、温度循环参数PCR反应的优点：1、操作简单 2、通用性好 3、成功率高PCR主要参数确定：主要参数确定：退火温度退火温度MgMg2+2+反应时间循环次数反应时间循环次数RE1RE2Sequencing已知靶序列扩增侧翼序列的PCRPCR常规PCR衍生的几种基因克隆技术（一）反向PCR (inverse PCR)（二）热不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)简并引物是指用

27、来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。 原理：根据目标序列的侧翼已知序列设计个嵌套的特异引物（sp1, sp2, sp3,约20bp），用它们分别和一个具有低Tm值的短随机简并引物（arbitrary degenerate primer, AD, 约14bp)相结合，以基因组为模板，根据引物长度及特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。 TAIL-PCR分三轮反应（1 1）提取基因组 total RNAtotal RNA（2 2）反转录合成总cDNAcDNA作模板（4 4）PCRPCR扩增（3 3）根据目的基因序列设计引物原核生物不易得到mRNAmRNA，也不含有po

28、lyApolyA尾。适合扩增真核生物基因。目的基因 的引物1 1反转录成目的基因cDNAcDNA第一链目的基因 的引物2 2目的 基因cDNAcDNA第二链PCRmRNA（四）锚定PCR PCR （五）cDNAcDNA末端的快速扩增cDNAcDNA末端的快速扩增（rapid amplification of rapid amplification of cDNA ends, RACEcDNA ends, RACE）是克隆目标基因cDNAcDNA的一种常用方法。这种方法根据基因编码蛋白的同源性或者多个同源基因cDNAcDNA比较的变异情况，将同源性基因cDNAcDNA的核心区段分析出来，针对核心

29、区段保守性高的位点设计引物，然后运用RT-PCRRT-PCR先扩增和克隆核心序列区。在测定核心序列后，根据核心序列设计新的引物并分别进行cDNA 3cDNA 3 端和5 5 端的扩增。最后拼凑成cDNAcDNA全序列的信息并设计新的一对引物将其RT-PCRRT-PCR扩增并克隆。GAAAAAAAAAAAReverse transcriptoligo(dT)dNTPsreverse transcriptaseGAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTmRNAcDNAPCRdegenerate primersTaq polymerasesequence and designRACE prime

30、rs5 RACE3 RACEAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTGAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTRACE RACE 示意图 利用oligo(dT)oligo(dT)引物反转录cDNAcDNA第一链后，以核心区段引物扩增出中间核心片段，测序后可以设计出3 3 RACERACE的上游引物和5 5 的下游引物，3 3 端上游引物结合oligo(dT)oligo(dT)下游引物将cDNA3cDNA3 端克隆出来。1.1.分析核心区段 利用已克隆的人和果蝇的基因资料，克隆蚊子的胰蛋白酶基因cDNAcDNA。先比较人和果蝇胰蛋白酶氨基酸序列的同源性 . .2.2.设计简并引物和扩增核

31、心区段 氨基酸序列 W(Trp)V(Val)L(Leu)T(Thr)A(Ala)密码子UGGGTTTTAACTGCTCGCCACTTAAGCGGGA3.3.设计RACERACE引物扩增的核心区段克隆和测序后，即获得了目标基因中间部分的序列，根据这一序列分别设计3 3 RACE RACE的上游引物和5 5 RACE RACE的下游引物。4.34.3 端RACERACEcDNA 3cDNA 3 的快速克隆比较简单，根据中间核心序列设计出3 3 端RACERACE的上游引物后，利用oligo(dT)oligo(dT)作为下游引物，利用mRNAmRNA反转录体系作为模板，PCRPCR在两引物间将cDN

32、A3cDNA3 端扩增出来。 5. 5 5. 5 端RACERACE5 5 端RACERACE时，尽管其下游引物根据克隆的核心序列可以确定下来，但由于5 5 端上游序列还未知，上游的引物难以确定，因而5 5 RACE RACE要采用一些特殊方法确定其上游引物位点。 BDBD公司SMART cDNA 5SMART cDNA 5 端RACERACE试剂盒原理图在反转录酶（RTRT）作用下，利用Oligo(dT)Oligo(dT)作引物合成cDNAcDNA第一链，RTRT在cDNAcDNA第一链末端延伸合成了几个C C碱基，体系中加入的3 3 端为G G碱基的寡聚序列与cDNAcDNA末端互补，作为

33、cDNAcDNA继续延伸合成的模板，在cDNAcDNA的末端合成出一段已知序列，形成5 5 RACERACE的引物位点。五、 根据基因差异表达获得目的基因1.1.差异显示PCRPCR（DD-PCRDD-PCR）差异显示技术的原理和实验程序: : 19921992年，LiangLiang和PardeePardee首次提出差异显示技术(DD-PCR)(DD-PCR)，其基本原理是，利用一系列的oligo(dT)oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNAmRNA，通过PCRPCR扩增的方法，转换成cDNAcDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基

34、因。其技术一般包括下列步骤：(1)(1)从植物组织中提取总RNARNA，在这个步骤中注意不能有DNADNA污染，一般用无RNARNA酶的DNADNA酶在3737下处理30 min30 min；(2)在在逆转录酶作用下，以Oligo (dTMN)Oligo (dTMN)为引物(M(M为G G、A A、 C C中的任一种，N N为A A、C C、G G、T T任一种) )，进行逆转录；(3)PCR(3)PCR反应，扩增cDNAcDNA的第一条链；(4)(4)扩增后的cDNAcDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表达的cDNAcDNA片段在6%6%测序胶上分开；(5)(5)找出不同处理间差异显示的条

35、带，从胶上切割下来，并回收，再进行第二次扩增；(6)(6)克隆差异片段，差异片段可作为探针；(7)Northern (7)Northern 杂交，验证目的片段，去掉假阳性片段；(8)(8)对目的片段进行测序；(9)(9)以克隆的目的片段为探针，从基因组文库中筛选出相应的全长基因。DD-PCRDD-PCR法具有快速、灵敏、简单和可分析低丰度mRMAmRMA的优点已为植物的基因表达研究和基因克隆所证实。但也有一些缺点，如扩增片段短、假阳性高、检测全部mRMAmRMA工作量大、基因的克隆受mRMAmRMA表达的时效性影响等。 DD-PCRDD-PCR的技术流程mRNA differential di

36、splay RT-PCRmRNA differential display RT-PCR（1 1）3 3端的锚定引物Oligo(dT)Oligo(dT)引物的3 3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T T）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC53AGTTTTTTTT53CGTTTTTTTT53GGTTTTTTTT53TGTTTTTTTT53AATTTTTTTT53CATTTTTTTT53GATTTTTTTT53TA TTTTTTTT53ACTTTTTTTT53CCTTTTTTTT53GCTTTTTTTT53TCTTTTTTTT53

37、10merAAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NMTTTTTTTT53扩增cDNAcDNA第一链。RTNMTTTTTTTT5cDNA 3NNNNNNNNNN53NNNNNNNNNN53cDNAcDNA第二链，并PCRPCR1212种锚定引物，若与2020种随机引物，可组成240240组引物。引物组合：240240组在能分出2000020000多条带！实验结果：如果每条带相当于一种mRNAmRNA，20000 mRNA20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNAmRNA。在测序胶上，每组扩出50-10050-100条长度为100-100-500bp500bp的带。不同组织

38、的240240组引物组合PCRPCR产物在测序胶中电泳。选择有差异的带，进一步PCRPCR作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。3.3.代表性差异分析 此法是由HubankHubank和Schatz1994Schatz1994年提出的。将合成的cDNAcDNA酶切，通过降低cDNAcDNA群体复杂度和多次更换cDNAcDNA两端接头等方法，特异扩增目的基因片段，重复性好，假阳性低。其主要步骤是，提取总RMARMA，逆转录合成cDNAcDNA，用识别4 4个碱基的限制性内切酶消化，连接接头，扩增出不同的代表子，进行TesterTester与DriverDriver杂交，消减杂交富集，从而找出

39、差异cDNAcDNA片段。SchematicdiagramofimprovedcDNArepresentationaldifferenceanalysis(RDA)procedureBasicstrategyforcDNA-basedrepresentationaldifferenceanalysis. 第五节第五节 重组重组DNA向宿主细胞内转移技术向宿主细胞内转移技术由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。转化：是指微生物细胞直接吸收外源DNA的过程。是使重组体DNA分子在热休克的短暂时间内被导入受体。热休克后将受体菌在不含

40、抗生素的培养液中生长至少30分钟以上，使其蛋白得到足够表达，以便能在含抗生素的琼脂培养平板上生长。由于E.coliX1776菌株用CaCl2处理后制备的感受态细胞长期冷藏仍能保持其摄取外源DNA的能力，故常用作受体菌。 转染：是指噬菌体、病毒、或以其为载体构建的重组DNA导入细胞的过程。 (其中又分磷酸钙沉淀法与体外包装法)转导：重组的噬菌体DNA或重组的粘粒DNA必须包装成完整的噬菌体颗粒，通过温和噬菌体颗粒的释放和感染将重组DNA转移至宿主内的过程。重组DNADNA导入受体细胞的途径转化：transfermationtransfermation，通过生物学或理化方法使质粒DNADNA或以质

41、粒DNADNA为载体构建的重组DNADNA导入受体细胞内，并在受体内稳定维持和表达的过程，主要用于原核生物。转染：transfectiontransfection，是转化的一种特殊形式，指病毒或以病毒为载体构建的重组DNADNA导入受体细胞，并使宿主遗传性状发生改变的过程，其中包括DNADNA、RT-DNART-DNA及RNAiRNAi，主要用于原核生物。转导:( transduction ) 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。1.直接转化法有的微生物细胞在不加任何处理的情况下就能直接摄取外源DNA，只要外源DNA与这样的细胞混合，在适宜的条件下悬浮培养，就能完成外源DNA的转化。

42、细菌转化：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫给体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株叫受体菌株。大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞，即在冰浴中用一定浓度的CaClCaCl2 2处理对数生长期的大肠杆菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+Rb+、Mn2+Mn2+、K+K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇(DTT)(DTT)或用氯化己胺钴处理制备感受态细胞。感受态：是指受体细胞能吸收外源DNADNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。感受态细

43、胞(competent cell):具有易于接受外源DNA能力的细胞。基因工程中，宿主细胞需经人工处理成能吸收重组DNA分子的敏感状态，才能用于转化，这种敏感细胞称为人工感受态细胞。感受态细胞的制取一般是将细菌（如大肠杆菌等）用一定浓度的冰冷CaCl2处理而得。1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞变为感受态细胞。 为了得到较好的感受态细胞，需注意以下几点：1、细胞要处于对数生长期2、整个制备过程要在低温（04）进行3、为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液操作程序：1处于对数生长期的细菌置于0的CaCl2低

44、渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞磷脂层形成液晶结构，使得外膜与内膜间隙的部分核酸酶离开所在区域，构成大肠杆菌人工诱导的感受态；2加入DNA，Ca2+与DNA形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜外表面；3经短暂42热激处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，出现许多间隙，导致通透性增加，DNA分子进入细胞中。2.化合物诱导转化法原理：外源DNA与多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）、二价阳离子（Mg、Ca、Mn等）混合，再与受体细胞或原生质体混合，可使外源DNA进入细胞。尤以PEG应用最广，可用于原核生物细胞、动物细胞和植物原生质体的基因转化。

45、PEG介导基因转化 Davey1980年和Krens1985年首先建立的。 步骤 转化培养：将制备的原生质体悬浮液与重组DNA一起保温培养，同时加入PEG在pH8-9下促进原生质体摄取DNA，从而使细胞转化。 通常使用的PEG分子量3000左右。 转化效率很低10-510-63.高压电穿孔转化法（1）Electroproration原理：利用高压电脉冲作用，使细胞膜上产生可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA和高分子物质进入细胞质内而实现基因转化，但不伤及细胞，切断电场后，被击穿的膜孔可以自行恢复。当电场强度和脉冲时间结合导致50-70%细菌死亡时，转化水平最高。（2）过程：把宿主细胞置于外加电场

46、中，通过电脉冲作用在细胞膜上打孔，DNA分子进入细胞。（3）条件：电压300600V、时间20100ms、温度0。（4）适用范围：酵母菌、霉菌等真核生物，适用于农杆菌感染不敏感的植物。（5）形式：电穿孔电穿孔+PEG。转化效率10-510-6，1.2%例如：高压电穿孔法转化细菌对数生长期的细菌对数生长期的细菌冷却冷却离心离心低盐缓冲液清洗低盐缓冲液清洗用用10%甘油悬浮细胞甘油悬浮细胞干冰速冻干冰速冻-70贮存贮存有效期有效期6W外加外加电场电场（300-600V维持维持20100ms）电脉冲电脉冲转化细胞转化细胞0-4 4.微弹轰击转化法（microprojectilebombardment

47、,particlebombardment）该法亦称基因枪法(particlegun)，粒子轰击法，生物弹法（Biolistics）。（1）原理：金属微粒在外力作用下，达到一定速度后，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随金属颗粒一起进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害而维持正常的生命活动。（2）过程：外源DNA与钨、金等金属微粒混合，使DNA吸附在微粒表面；用基因枪轰击，通过氦气冲击波使DNA随金属微粒进入植物细胞。（3）适用范围：植物细胞。（4）特点：操作简单，转化率高，省去了分离原生质体的麻烦，耗资较大。DNA微粒载体的制备原理是CaCl2对DNA沉淀作用，亚精胺、聚乙二醇具有粘附作用、将

48、这些化合物与DNA混合后与钨粉或金粉混合，吹干后，则DNA沉淀在载体颗粒上基因枪介导的DNA转移基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford(1987)最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。 一类是以火药爆炸力作为动力加速微弹； 第二类是以高压气体(highpressuregas)作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。其工作原理是把载有DNA的钨(金)粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴着微水滴。在压缩空气的冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。当载片受阻于金属筛网时,载有DNA的钨(金)

49、粒继续向下冲击射入细胞。第三类是以高压放电为驱动力。其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的钨(金)粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。这一点非常重要，因为不同的外植体需要不同的参数。采用该放电轰击、已在大豆和水稻上成功地获得了转基因植株(Christou等，1992)5.显微注射法（microinjection）（1）原理：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核（需用特制的玻璃微管）。倒置显微注射仪（2）过程：将外源基因直接注入实验动物受精卵原核，外源基因整合到动物基因组，通过胚胎移植把含有外源基因的受精卵移植到受体子宫并

50、发育。（3）适用范围：真核生物，早期用于动物，现已应用于植物。（4）特点：繁琐耗时、转化率高，但需专门的显微注射仪，且要求操作者有精细的操作技术和低密度细胞培养技术。受体细胞的固定动物细胞具有独特的贴壁生长待性，不存在固定细胞的问题植物细胞必须先建立细胞固定技术目前有三种方法：琼脂糖包埋法：把低熔点的琼脂糖熔化，冷却到一定温度后将制备的细胞悬浮液混合于琼脂糖中。需要注意的问题是，在包埋时细胞约1/3-1/2暴露在琼脂糖表面，即细胞体的一半埋在琼脂糖中，起固定作用，暴露的一半细胞可一进行微针注射、否则琼脂固化后很难进行。多聚-L-赖氨酸粘连法：先用多聚-L-赖氨酸处理玻片表面，由于聚赖氨酸对细胞

51、有粘连作用，因此当分离的细胞或原生质体与玻片接触时被固定在玻片上。而且一个破片上可固定较多数量的细胞或原生质体。吸管支持法：用一固定的毛细管将原生质体或细胞吸着在管口起到固定作用，然后再用微针进行DNA注射。这种方法的优点是吸管可以旋转或移动位置使操作者能选择最佳位置进行注射。显微注射用的微针通常用拉针机制备，尖针直径以0.5m左右为宜。一次注入细胞质中的DNA量约为10-9ml。转化率及影响因素显微注射虽然操作繁琐耗时，但其转化效率很高已发展出一套完善的技术，在烟草、油菜、苜蓿等植物的原生质体转化率高达60以上。影响转化率的因素。(1)原生质体的成活率是转化率的重要因素，只有注射那些能够分裂

52、、成活的原生质体才能得到转化。因此，注射时要选择启动分裂、细胞壁开始形成的原生质体进行注射。(2)线性DNA比环形DNA具有更高的转化率。(3)操作要迅速敏捷，选择最佳的注射强力和浓度，使细胞的损伤减少到最小程度。(4)固定技术要可靠，不能损伤细胞。显微注射特点方法简单、转化率高；6-8%它是一种纯粹的物理方法，适用于各种植物和各种材料，无局限性；整个操作过程对受体细胞无药物等毒害，有利于转化细胞的生长发育；转化细胞的培养过程无需特殊的选择系统。缺点是需要有精细操作的技术及低密度培养的基础，注射速度慢、效率低，要求研究者有耐心。6. 6. 脂质体（liposomeliposome）介导法（1）

53、原理：受体细胞的细胞膜表面带负电荷，脂质体颗粒带正电荷，利用引力的作用把遗传物质导入细胞内。即用脂类化学物质包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。脂质体是根据生物膜的结构功能特性合成生物膜，然后把DNA包裹在人工膜内。（2）过程：在形成脂质体时，把用来转染的目的DNA分子包裹在其中；脂质体与细胞接触；外源DNA分子导入受体细胞。（3）适用范围：真核细胞。（4）特点：包在脂质体内的DNA可免受细胞内核酸酶的降解，所以可直接转化外源DNA；对植物病毒RNA的转化率高；如用PEG诱导脂质体与原生质体融合可获得高的转化率。410-5(5)影响脂质体转化率的因素很多：脂

54、质体的制备类型、方法均有明显差异；PEG的浓度、加入时间、PH值及ca”浓度均起到重要作用；保温培养及转化时的条件同样十分重要。7.花粉管通道法（1）原理：在花粉管通道形成之后封闭之前一段时间，使外源DNA能沿着花粉管通道进入胚囊，转化尚不具正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞，从而实现基因的转移。（2）适用范围：植物（3）特点：直接得到转化种子，不经过组培，减少了基因型的影响；操作简单经济，无需昂贵仪器和化学药品，可直接在大田操作；大量快捷，性状稳定，转化率高；可获得110-2110-1的高遗传转化率。 不仅可以导入供体的总DNA，而且可导入含目的基因的质粒，甚至可将化学诱变剂导入胚囊。缺

55、点：工作时间受自然花期限制，田间操作受环境影响大，基因组以随机方式结合，要求工作人员经济性要强，工作效率较低。 我国科学家周光宇在1983年首次在“MethodsinEn-zymology”报道的研究成果。 现该技术主要在蔬菜育种上应用。（白菜、茄子、黄瓜、番茄、辣椒等操作步骤: 1.外源DNA的制备 2.分析受体植物的受精过程及时间，确定导入外源DNA的时间方法（3种） 柱头涂抹法 柱头切除法 花粉粒吸入法 3.后代材料处理8.超声波介导转化法（1）原理：利用低音强脉冲超声波的物理作用，可逆性的击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA进入受体细胞。（2）特点：避免脉冲变电压对细胞的损伤，有利于

56、细胞存活整个操作转化率较高，如在转化反应中加入DMSO或携带DNA则转化率更高。60-70%（3）适用范围：微生物、植物过程:无菌材料的制备质粒DNA的提取超声波缓冲液配置超声波处理（去无菌材料切成小块，放入无菌超声波小室，同时加入5%DMSO缓冲液，质粒DNA20ug/ml及鲑鱼精DNA40ug/ml，室温下超声波处理30min）处理后用缓冲液洗3次接种在MS或其他培养基上培养9.激光微束穿孔转化法 早在1984年Tao等首先利用激光微束对动物细胞进行DNA转化试验、此庸Web等利用激光微束技术对原生质体、花粉以及活细胞内的叶绿体进行外源DNA导入获得成功，并用荧光标记的大肠杆菌pBR322

57、质粒DNA在转化细胞中得到检测。（1）原理：利用直径很小、能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理。在荧光显微镜下找适合的细胞，然后用激光代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔外于细胞周围的外源DNA分子随之进入受体细胞。（2）特点：操作简便快捷，转化效率高10-3-10-4，无宿主限制，但需要贵重仪器，技术条件要求高，稳定性和安全性不如电穿孔法和基因枪法。（3）适用范围：动植物细胞、组织、器官及线粒体、叶绿体。过程1）DNA的提取2)受体植物样品制备：将欲照射的植物细胞或组织用高渗缓冲液浸泡数分钟，不同作物不同外植体所用高渗液不同，浸泡时间也不同。3)转导细胞悬浮液准备：激光

58、照射前洗去高渗液，加新鲜培养液。吸取0.5mI细胞悬浮液，加50ul质粒DNA或植物外源DNA(浓度5ugml)一起注入激光微束系统的Rose小室。4)激光微束照射：激光微束显微照射装置如为NdYAG四集倍频脉冲激光冠微照射系统、即输出波长技需要选择，脉宽10-15ns。激光束引入一台相差显微镜，用40物镜聚焦Y于欲照射的细胞。光斑直径为1.3nm。照射时移动载物台，使激光脉冲在植物细胞团上进行扫描照射，照射时间每个佯品60分钟，约打7000个脉冲。5)培养：激光照射后，将样品用新鲜的培养液冲洗1-2次，然后接种在装有液体培养基的小培养皿中，25度条件下悬浮培养2-3天或固体培养。10.病毒颗

59、粒转导法（1）原理：用病毒(噬菌体)DNA(或RT-DNA)构建的克隆载体或携带目的基因的克隆体，在体外包装成病毒(噬菌体)颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA进入受体细胞，将此过程称为病毒(噬菌体)颗粒转导法。（2）适用范围：主要用于构建基因文库和目的转基因，早期也用于植物的转基因。（3）类型：带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因打随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上，这样以后不需要再包装成病毒颗粒。带有目的基因的病毒是缺陷型的，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞，在受体细胞内包装成新的病毒颗粒。虽然带有目的基因的SV40早期转录是缺陷型的，但被感染的cos细胞系的

60、基因组中整合的SV40早期转录区段DNA，所以无需辅助病毒做混合感染。11.磷酸钙转染法（1）原理：哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。（2）基本操作过程：将待转染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的Hepers-磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物；用吸管将沉淀复合物黏附在哺乳动物单层培养细胞表面；保温几小时后，用新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养茹继续培养，直至外源基因表达。（3）特点：多使用高浓度的DNA，1050g/ml；保温时间随受体细胞而异；Hepers-磷酸钙溶液应不断搅拌，DNA溶液则应缓慢加入