基因工程操作

1、一、基因工程的原理是什么? ? 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过_和_等技术，赋予生物以新的_，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 DNA 重组技术的基本工具“分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车”限制（性核酸内切）酶DNA连接酶基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶 主要是从 的一种酶。 识别双链DNA 分子的某种 ，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。 形成两种末端原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列磷酸二酯键粘性末端平末端二、 “分子缝合针” DNA连接酶1、种类：2、作用部位：两类连接黏性末端Ecoli DNA连接酶T4 DNA连接酶磷

2、酸二酯键连接黏性末端和平末端基因进入受体细胞的载体通常有三种:作为载体的条件： 在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在 质粒噬菌体衍生物动植物病毒天然质粒人工改造的能自我复制；有切割位点；能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离基础上进行过基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与表达、目的基因的检测与表达一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的

3、基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）从基因文库中获取从基因文库中获取（2 2）利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成人工合成请阅读请阅读P9-11P9-11页页非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码

4、蛋白质的序列叫做内含子内含子：内含子： 外显子：外显子： 结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较 由于原核生物没有内含子由于原核生物没有内含子( (没有内含子剪没有内含子剪接系统接系统), ),动物和植物内含子的剪接系统不同动物和植物内含子的剪接系统不同, ,所以不能相互剪接内含子所以不能

5、相互剪接内含子, ,所以只能用没有所以只能用没有内含子的内含子的cDNAcDNA。连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因前提前提: :已知目的基因的脱氧核苷酸序列已知目的基因的脱氧核苷酸序列方法：方法：1.1.DNADNA受热（受热（9090-95-95O OC C）变性解旋为）变性解旋为单链单链2.2.冷却后（冷却后（5555-60-60O OC C）DNADNA引物与单引物与单链相应互补序列结合、链相应互补序列结合、3 3. .在适宜的温度下（在适宜的温度下（70-7570-75O OC C）热）热稳定稳定DNADN

6、A聚合酶（聚合酶（T Taqaq 酶）作用下酶）作用下延伸合成互补链延伸合成互补链。指数增长归纳模板DNA95PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCRPCR的基本原理的基本原理PCR

7、反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 利用PCR技术扩增目的基因原理：在原理：在体外体外进行进行DNADNA复制复制

8、DNA复制基本条件复制基本条件DNA复制中的作用复制中的作用DNA双链双链DNA母链母链DNA复制模板复制模板DNA聚合酶聚合酶催化合成催化合成DNA子链子链DNA聚合酶正常工作聚合酶正常工作 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：选修选修1 P1 P6060聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基

9、因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570

10、-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链三、人工合成 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可 以通过DNA合成仪用化学方法之间合成！5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因二、二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目

11、的并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因目的基因的表达所需物质：1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒

12、）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建4.4.过程过程: :( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目

13、的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1 1）农杆菌介绍：）农杆菌介绍：（2 2）原理及适用范围）原理及适用范围( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法）方法：显微注射法

14、（2）程序：）程序：( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：）方法： 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的

15、基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交巩固练习：1、有关基因工程叙述正确的是（ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成是在细胞内完成的 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料2、下列关于酶的说法不正确的是（ ）A、限制酶广泛存在于各种生物中，微生物中很少分布B、一种限制酶只能识别一种特定的

16、核苷酸序列C、不同的限制酶切割DNA的切点不同D、限制酶的作用主要是用来提取目的基因3、下列哪项不是基因工程中经常使用的用来运载目的基因的载体（ ） A、细菌质粒 B、噬菌体 C、动植物病毒 D、细菌核区的DNAD D AD 4、下列说法正确的是（ ） A、DNA连接酶最初是从人体细胞中发现的 B、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列 C、质粒是基因工程中唯一用作运载目的基因的运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”5、20世纪70年代，创立了一种新兴的生物技术基因工程，实施该工程的最终目的是（ ） A、定向提取生物体的DNA分子 B、定向地对DNA分子进

17、行人工剪切 C、在生物体外对DNA分子进行改造 D、定向地改造生物的遗传性状D D 6、下列关于基因工程的叙述中错误的是（ ） A、基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿定向改造生物，培育新品种 B、基因工程技术是唯一能冲破远缘杂交不亲和障碍，培育生物新类型的方法 C、基因工程的基本工具是：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和基因的运载体 D、基因工程的研究成果，目前大多需要通过发酵工程和酶工程来实现产业化7、在基因工程中，作为基因运输工具的运载体，下列特征除哪项外，都是运载体必须具备的条件（ ） A、能够在宿主细胞中复制，并稳定地保存 B、具有多个限制酶切点 C、必须是细菌的质粒或噬菌体 D、

18、具有某些标记基因BC1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具

19、有标记基因 D、它是环状、它是环状DNA3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都

20、可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料资料5）基因工程是在）基因工程是在DNA分子水平上进行设计分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码

21、蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）从基因文库中获取从基因文库中获取（2 2）利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成人工合成请阅读请阅读P9-11P9-11页页结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细

22、胞与真核细胞的基因结构比较 由于原核生物没有内含子由于原核生物没有内含子( (没有内含子剪没有内含子剪接系统接系统), ),动物和植物内含子的剪接系统不同动物和植物内含子的剪接系统不同, ,所以不能相互剪接内含子所以不能相互剪接内含子, ,所以只能用没有所以只能用没有内含子的内含子的cDNAcDNA。连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：选修选修1 P1 P6060聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片