如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡

1、一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺喀咤核昔（3H-TdR）渗入法胸腺喀咤核昔（TdR是DNA寺有的碱基，也是DN蛤成的必需物质。 用同位素3H标记 TdR即3H-TdR作为DN蛤成的前体能掺入 DAN成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度， 可以反映细胞 DAN的代谢及细胞增殖情况。但是具有放射性。2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（ CFSE检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使 CFSE成为一种良好的细胞标记物。

2、CFSBS入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在 488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。 3、Brdu检测法Brdu中文全名5-澳脱氧尿喀咤核甘，为胸腺喀咤的衍生物，可代替胸腺喀咤在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗 Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增 殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究 细胞动力学有重要意义 4、增殖标志检测有些抗

3、原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的 单抗来对细胞增殖进行检测。例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在 G0期和G1期（非增殖期）不表达。用针对 Ki-67蛋白的单抗 就可以检测细胞的增值情况。由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。（2）间接方法：通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力 1、MTT检测法MTT检测法主要反

4、映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法，其 原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成兰紫色的甲（Formazan）,生成的甲量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比。2、ATP检测细胞内的ATP含量受到了严格调控， 检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含 ATP,在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase 及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够为您提供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发 光强度与ATP浓度成正

5、比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。二、检测细胞分化的方法1、流式鉴定细胞表面标志，以判断细胞是否分化2、观察细胞形态，与已分化的细胞进行对比3、分化诱导评估其分化能力三、检测细胞凋亡的方法(1)形态学检测1、光学显微镜和倒置显微镜染色细胞：凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。常用染色方法：苏木精=伊红染色甲基绿-派诺宁染色：与坏死相比，细胞凋亡的细胞内常有RNA表达的增强，用甲基绿特异性染色DNA派诺宁对RNAH和力强，若胞质呈派诺宁阳性为凋亡，阴性为坏死。(前提是已经判断细胞处

6、于死亡形态，通过形态学判断)口丫咤橙染色法：。它与细胞中DNA RNA结合量存在差别，可发出不 同颜色的荧光，与DNA吉合量少发绿色荧光， 与RNA吉合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DN用口 RNA色。因此，在荧光显微镜下观察，口丫咤橙可透过正常细胞膜， 使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。口丫咤橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。口丫咤橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。(凋亡小体)2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来

7、评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA寺异性染料有：HO33342 (Hoechst 33342) , HO33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在 DNA勺A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸储水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为 25mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用 蒸储水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：I期的细胞核呈波纹状(rippl

8、ed) 或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态；n a 期细胞核的染色质高度 凝聚、边缘化；nb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(如图) 。3、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡I期( pro-apoptosis nuclei )的细胞核内染色 质高度盘绕，出现许多称为气穴现象( cavitations )的空泡结构(如图)；Ha期细胞核的 染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。(2)检测凋亡标记物质1、磷脂酰丝氨酸外翻分析 (Annexin V 法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine.PS) 正常位于细胞膜的

9、内侧，但在细胞凋亡的早 期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为 3536KD的Ca2然赖性磷脂结合蛋白，能与 PS高亲和力特异性结合。将 Annexin-V 进行荧光素(FITC、PE)或biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针， 利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙咤(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋 亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死

10、细胞区分开来。2、线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件， 它发生在细胞核凋亡特征 (染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6(3) 、 Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1 、Tetramet

11、hyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为 DiOC6(25nM), JC-1(1mM), TMRM(100nM) 37° C 平衡 30min ,流式细胞计检测细胞的荧 光强度。3、TUNELt细胞凋亡中，染色体DNAZ链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核甘酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核甘酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷 酸酶或生物素形成白衍生物标记

12、到DNA勺3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法(称为脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling, TUNEL) 。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没 有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态 学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检

13、测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。（3） DNA断化检测1、大分子染色体DNA片段的测定细胞凋亡的早期，染色体断裂成为50300 kbp长白D DNA片段。所有超过一定分子量大 小的双链DNA子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA勺双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50300 kbp长白D DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术 可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝

14、胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。 DNA子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNAa可以按其分子量大小分开。2、DNA Ladder 测定细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50300 kbp长白DNM片段，或180200 bp整数倍的寡核甘酸片段，在凝 胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA进行琼脂糖凝胶和澳化乙咤染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的D

15、NA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA,用32P-ATP和脱氧核糖核甘酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。3、凋亡细胞DN哈量的流式细胞计分析（4） Caspase-3活性的检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致

16、细胞凋亡。 但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。 1、western blot2.荧光分光光度计分析活化的Caspase-3能够特异切割 D1E2V3D4-X!S物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设 计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC在共价偶联时，AM怀能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC自由的AMCt能被激发发射荧光。根据释放的AM吸光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映 Caspase-3被活化的程度。（5）凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析TFAR19（PDCD现促进细胞凋亡的增强剂。 利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体 为探针，对