实用pcr流程表

1、临床 PCR检验流程记录表检验日期：检验项目：HBV-DNA扩增仪中保存文件名使用说明： 严格按单一流向进行实验，即试剂准备区标本制备区扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；各项工作执行后在相应项目前的方框内打“” ；本记录表最后归档保存在 PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。实验前准备试剂在有效期内扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1 年）生物安全柜的滤膜在使用有效期内离心管、带滤芯吸头已经过质检合格各区按消毒液配制SOP配制 500mg/L 含氯消毒液、 2000mg/L 含氯消毒液和 70%酒精，即用即配。打开通风设备操作者试剂准备区实验

2、前： 更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L 含氯消毒液、 70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（2 8）；冷冻室（ -20 ± 2）实验室温度（允许范围：15 30）；相对湿度：（允许范围：30% 70%）PCR试剂来源：试剂厂家：口深圳匹基生物工程有限公司批号：检验项目：HBV-DNA本次实验用量：人份；剩余量：人份其他有关试剂配制：仪器设备使用：离心机：正常不正常；振荡器：正常不正常；生物安全柜：口 正常口 不正常实验后： 按实验室清洁消毒 按实验室废弃物处理SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射SOP处理实验废弃物。30 分钟以上

3、。操作者检验日期：检验项目：HBV-DNA样本处理区实验前： 更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（2 8）；冷冻室（-20 ± 2）实验室温度（允许范围：15 30）；相对湿度：（允许范围：30% 70%）HBV-DNA阳性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：HBV-DNA阴性室内质控物来源：批号：扩增位置：所处理的 HBV-DNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：1917253341495765738189210182634425058667482903111927354351596775839

4、14122028364452606876849251321293745536169778593614223038465462707886947152331394755637179879581624324048566472808896核酸提取及加样过程：按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。仪器设备使用：生物安全柜：正常不正常；恒温金属浴：；离心机：正常不正常；振荡器：正常不正常；低温离心机：制冷：正常不正常；离心：正常不正常实验后： 按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射 按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。口 使用后标本冷冻保存3 个

5、月，以备复查。30 分钟以上。操作者检验日期：检验项目：HBV-DNA扩增及产物分析区实验前： 更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（ 500mg/L 含氯消毒液、 70%酒精或水擦拭）实验室温度（允许范围： 15 30）；相对湿度：（允许范围：30% 70%）LightCycler扩增仪操作：开机自检及运行正常； 按 LightCycler操作使用 SOP进行编程、参数设定HBV-DNAIntercept值：r2值：标准曲线计算值： Slope 值：室内质控结果： 阴性质控物结果：；阳性质控物结果：口填写室内质控记录、质控图；是否失控： 口否口是室内质控结果： 阴性质控物结果：；阳

6、性质控物结果：口填写室内质控记录、质控图；是否失控： 口否口是失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按室内质控SOP进行）实验结果： 见所附扩增仪打印结果实验结果有效性判断： 有效实验后： 按实验室清洁消毒 按实验室废弃物处理无效（依据实验结果有效性判断SOP进行）SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射SOP处理实验废弃物。30 分钟以上。操作者1. 操作步骤：取 n 个 1.5ml 的灭菌离心管，作好标记。 （ n=样本数 +1 管 HCV阴性对照 +1 管 HCV强阳性对照 +1 管 HCV临界阳性对照）向上述离心管中分别加入25ul 蛋白酶溶液。分别加入待测样本、

7、 HCV阴性对照、 HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.加入 200ul 新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15 秒，充分混匀。（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。56 摄氏度温浴 15 分钟。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。加入 250ul 无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15 秒）。在室温下静置5 分钟（ 15-25 摄氏度）。注意：如果环境温度超过 25 摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。1.2.7将 n 个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6 中的液体移入核酸提取柱中。盖上盖子， 6000*g 离心 1 分钟。倒掉收集管中的

8、废液，将提取柱重新放入收集管中。（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul 洗液 1，盖上盖子， 6000*g 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul 洗液 2，盖上盖子， 6000*g 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul 无水乙醇，盖上盖子， 6000*g 离心 1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。1.2.1120000*g 高速离

9、心 3 分钟，彻底去除乙醇。丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的1.5ml 离心管中，打开提取柱的盖子，56 摄氏度温浴 3 分钟，以彻底去除残余的液体。1.213 将核酸提取柱放入另一干净的 1.5ml 离心管中，小心打开提取柱的盖子， 加入 60ul 洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央） ，盖上盖子，室温静置 5 分钟。20000*g 高速离心 1 分钟收集滤出液，做好标记， 4 摄氏度保存备用。提取的病毒核酸应在 2 小时内用于 PCR扩增，或在 -70 摄氏度下可以保存一个月。2. 扩增试剂准备（ PCR前准备区）从试剂盒中取出 HCV RT-PCR反应液、 Enzyme Mix , 在室温

10、下融化后， 2000*g 离心 5秒。设所需要的 PCR反应管数（玻璃毛细管）为 n（n=样本数 +1 管空白对照 +1 管 HCV 阴性对照 +1 管 HCV强阳性对照 +1 管 HCV临界阳性对照 +4 管 HCV定量标准品），每个测试反应体系配制如下表：试剂HCV RT-PCR反应液Enzyme Mix用量n*13uln*2ul计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g 离心 10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul ，转移至样本处理区。3. 加样（样本处理区）吸取 10ul 样本处理步骤中收集得到的 RNA溶液及 HCV定量标准品分别加入到上述反应管中 （空白

11、对照直接加入 10ul 洗脱液），盖紧反应管管盖， 连同 Roche专用金属反应管套放在离心机中， 于 2000*g 离心 10 秒，将毛细管转移到检测区。 将毛细管排放好放入荧光 PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。4. RT-PCR 反应（检测区）4.1循环条件设置Program CyclesTemperatureIncubationTemperatureAcquisitAnal摄氏度Time(min:secTransitionionysis)Rate(ModeMode摄氏度 /sec)115030:0020NoneNone219515:0020NoneNone9500:0520NoneQu

12、an3455000:3020Singletifi7200:2010Nonecation反应体系为 25ul. 具体设置方法请参照各仪器使用说明书。4.2仪器检测通道选择选择 F1 检测通道： HCV内对照（ IC）选择 F2 检测通道。4.3样本的设定在扩增开始前条件设定时，将 HCV定量标准品设为“ Standard ”并输入试剂盒内给定浓度值，待检样本和对照品设定为“ Unknown”。结果分析条件设定1. 对 HCV的曲线和 HCV内对照（ IC）的曲线进行分别分析。2. 分析方式选择 Fit Points ，基线调整选择 Arithmetic, 阈值（ threshold ）设定原则以

13、阈值线刚好超过正常 HCV阴性对照曲线的最高点，且正常 HCV阴性对照病毒滴度为 0.0IU/ml 为准。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。质控标准1. 将 HCV定量标准品 1-4 的浓度值输入，仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横坐标，以其实际测得的外标Ct 值为纵坐标给出标准曲线， 标准曲线的拟和度绝对值应大于等于 0.980 ，四个 HCV定量标准品的Ct 值都应 <38.0 ，否则视为定量结果无效。2. HCV阴性对照、空白对照 HCV RNA应为 0.0IU/ml ；HCV强阳性对照 HCV RNA应为5.0E+05-1.0E+07IU/ml ；HCV临界阳性对照应为

14、1.0E+03-1.0E+05 IU/ml ；且 HCV阴性对照、 HCV临界阳性对照中 HCV内对照（ IC ）的 Ct 值都应小于等于 33，否则此次实验视为无效。所有实验从样本处理开始重做。结果判断1. 检测样本中 1.0E+03 IU/ml 小于等于 HCV RNA小于等于 5.0E+07 IU/ml ，测定结果有效，可直接报告相应的浓度值。2. 检测样本中 HCV RNA大于 5.0E+07 IU/ml ，可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦可将该样本用正常人血浆按 10 倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。3. 检测样本中 0.0IU/ml 小于 HCV RNA小于 1.0E+03 IU/ml ，且 HCV内对照（ IC）的 Ct值都应小于等于 33，表明病毒载量较