基因工程2011

1、1目的目的 获得某一感兴趣的基因或获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现实现基因克隆基因克隆所所用的方法及相关的工作。用的方法及相关的工作。克隆（克隆（clone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝（）：来自同一始祖的相同副本或拷贝（copy）的集合。的集合。第一节第一节 基因工程的基本原理基因工程的基本原理2基因工程技术的基本原理DNA克隆,又称分子克隆、基因克隆 / 重组DNA 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子，

2、继而通过转化或转染宿主细胞， 筛选出含有目的基因的转化细胞， 再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。实现基因克隆所采用的方法及其相关的工作统称重组DNA技术，又称基因工程。3第二节 基因工程的物质基础一、工具酶 （一）限制性核酸内切酶 （二） DNA聚合酶 （三） DNA连接酶 （四） 其它DNA修饰酶4限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并并在识别位点或其周在识别位点或其周围围切割双链切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。的一类内切酶，简称限制酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATC

3、C GBam H定义：（一）限制性核酸内切酶 restriction endonuclease5作用：作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型），型）， 型型内切作用内切作用具有序列特异性。具有序列特异性。6第一个字母取自产生该酶的细菌第一个字母取自产生该酶的细菌属属名，用大写；名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的第二、第三个字母是该细菌的种种名，用小写；名，用小写；第四个字母代表第四个字母代表株株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的

4、先后次序。命名Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶7类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 反转对称结构。 限制酶识别序列的长度一般为4-6个核苷酸。切割DNA分子中的磷酸二酯键，产生5-P、3-OH的DNA片段。 限制酶切割DNA分子形成黏性末端(sticky end)和平末端(blunt end)两种 。8Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口9来

5、源不同，来源不同，但能识别和切割同一位点但能识别和切割同一位点的限制酶的限制酶，称为，称为同功异源酶。同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功异源酶（同裂酶）10来源不同，识别序列不同，来源不同，识别序列不同，但但切割切割DNA后产生相同的粘性末端后产生相同的粘性末端。这两个相同的粘性末端称为这两个相同的粘性末端称为配伍未端配伍未端(compatible end)。Bam HBgl GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A同尾酶：11

6、限制性核酸内切酶的星号活性: 不同限制酶需要不同的反应条件以获得最佳切割靶DNA的效率。 在非标准反应条件下会导致限制酶切割DNA的效率改变，即酶能切割一些与其特异性识别序列类似的序列，这种现象称为星号活性。如EcoR1*,当它表现为星号活性时，其特异性由6 nt GAATTC降为4 nt AATT。有些酶有星号活性，有些没有。12（二）DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA pol 具有53聚合酶活性。53外切酶活性，3 5外切酶活性。 制备DNA探针、DNA序列测定。2. Taq DNA聚合酶 具有53聚合酶活性，53外切酶活性， 用于PCR反应和DNA序列测定。133. 逆转录酶 主要2种，禽成

7、髓细胞瘤病毒AMV逆转录酶和Molonev小鼠白血病病毒MMLV逆转录酶。 53DNA聚合酶活性，RNase H活性。 用途：以mRNA为模板合成cDNA。4. Klenow酶 DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶水解后产生的大片段。具有53聚合酶活性，35外切酶活性。 用途：填补DNA双链的3末端，合成cDNA第二链，DNA序列分析。14（三）DNA连接酶（DNA ligase） 是基因工程中所必需的一类酶。它能催化DNA中相邻的5-磷酸和3-羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA单链切口连接起来，形成完整DNA分子。 分大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶。大肠杆菌DNA连接酶：只能连接双链只能

8、连接双链DNADNA的单链切的单链切口。口。T4DNA连接酶：不仅具有前者的作用，而且在高浓在高浓度的酶和度的酶和ATPATP存在下，还可将平端存在下，还可将平端DNADNA片段连起来。片段连起来。 15碱性磷酸酶 切除DNA或RNA 5端磷酸基。末端转移酶 催化脱氧核糖核苷酸逐个地加到DNA的3羟基末端。底物分子可以是具有3-OH末端的ssDNA，具有3-突出末端的dsDNA，某些条件下还可以是3-平端的dsDNA。 可使外源DNA片段及载体分子的3-OH加上互补的同聚物，形成人工黏端，或用于DNA3端末端标记。T4 多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase) 催化A

9、TP的-位磷酸转移到DNA分子的5-羟基末端。16二、二、基因载体基因载体（vector）定义定义能携带外源能携带外源DNA分子进入受体细胞并分子进入受体细胞并进行扩增和表达的运载工具。进行扩增和表达的运载工具。常用载体常用载体 质粒质粒DNA, 噬菌体噬菌体DNA, 病毒病毒DNA.17克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列序列被扩增被扩增而设计而设计的载体称为的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列序列被被转录翻译转录翻译而而设计的载体称为设计的载体称为表达载体

10、表达载体。基因载体种类18 （一）克隆载体 1. 质粒载体 2. 噬菌体载体 3. 酵母人工染色体载体 （二）表达载体 1. 大肠杆菌表达载体 2. 真核表达载体19基因载体应具备的条件：具有自主复制能力；有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆位点（multiple cloning sites，MCS），为多个限制酶的为多个限制酶的单一位点单一位点，便于外源基因的插入。便于外源基因的插入。具有一个或多个选择性遗传标记：抗生素的抗性基因，抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（Lac Z)Lac Z) 、营养缺陷型分子量小，能容纳较大的外源DNA分子；具有较高拷贝数，易于与受体细胞的染色体DNA

11、分开，便于分离提纯； 具有较高的遗传稳定性。20 （一）克隆载体1. 质粒 2. 噬菌体载体(bacteriophage，phage)（略）3. 酵母人工染色体 （略）211. 质粒 质粒（plasmid）是存在于细菌染色体之外的、具有自主复制能力的双链环状DNA分子。 常用的质粒载体有pBR322、pUC系列及TA克隆载体等多种。 22特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息遗传信息, ,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。宿主细胞：细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞。宿主细胞：细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞。 232

12、.有关的克隆质粒 （1）pBR322： 4.3kb带有一个复制起始点含 ampr 和 terr 抗性基因、含有多个单一限制性酶切点，插入失活。具有较小的分子量，易于自身DNA纯化，可携带6kb的外源基因。具有较高的拷贝数。 pBR3224363bp24（2）pUC系列：2.6kb在PBR322质粒载体的基础上改建而成，保留PBR322质粒的一部分，插入了来自M13噬菌体并带有MCS的LacZ基因。组成：复制起始位点、 pBR322的ampr（该基因的序列发生改变，不具有原来的酶切位点）Ecoli LacZ基因MCS，来自M13噬菌体，位于LacZ基因中近5端，不破坏LacZ基因的功能。 pUC

13、系列大多数是成对的：每一对（pUC18、pUC19)质粒的MCS中的酶切位点数目相同，顺序相反 。 25 互补互补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 26（3）TA克隆载体专门为克隆PCR产物而设计的一种特殊质粒载体。 其共同特点是在其MCS两侧的3端携带有未配对的T碱基、MCS均位于-半乳糖苷酶的片段内、都含有T7启动子。 由于大部分耐热的DNA聚合酶（Taq、Tth）扩增时都会有在PCR产物的3端加上一个A，可与载体的3端T互补连接，同时3端突出的T还可以防止载体自身环化，提高PCR产物的连接和克隆效率。 带有ampr 和LacZ 基因，可方便筛选阳性克隆。 优点：直接

14、克隆PCR产物。常见的常见的TA载体：载体： pBS-T， pGM-T和pCF-T27天根生物28二、表达载体 expressing vector表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体，它除了具有克隆载体所具有的性质外，还需要有能表达外源基因所必需的DNA序列（如启动子、核糖体结合位点和转录终止调控序列等）。表达载体：一个强启动子及其两侧的调控序列；有SD序列,该序列与起始密码子ATG之间要有合适的距离；在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有转录终止子等 29 按宿主细胞的不同，可将表达载体又分为： 原核细胞表达载体、原核细胞表达载体、 酵母细胞表达载体、酵母细胞表达载体

15、、 哺乳动物细胞表达载体、哺乳动物细胞表达载体、 昆虫细胞表达载体昆虫细胞表达载体。30（一）大肠杆菌表达载体表达：融合蛋白、非融合蛋白、分泌型蛋白。 表达载体构建： 启动子、 核糖体结合位点（起始密码子(ATG)和SD序列） 转录终止信号 T 7 噬菌体启动子：表达效率高 T 7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的p ET系统为杰出代表。 它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。 强大的T 7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T 7 RNA 聚合酶合成mRNA

16、的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T 7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。大肠杆菌表达载体 pRSET载体 它是一个两用载体，它既可作为表达融合型蛋白的载体，也可作为表达非融合型蛋白的载体。该载体含有Amp抗性基因和一个强的T7噬菌体启动子，在启动子与终止信号之间有RBS和多克隆位点。在RBS后紧接着的是起始密码子（ATG），在起始密码子与多克隆位点之间有一段大肠杆菌基因编码序列，编码一个31个AA的多肽，C端是一个

17、肠激酶肠激酶识别位点。用肠激酶水解去除大肠杆菌多肽，得到应表达的蛋白质。33 High-level expression from the bacteriophage T7 promoter N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification with ProBond resin(树脂) N-terminal Xpress epitope（表位） for protein detection with the Anti-Xpress Antibody Enterokinase cleavage site for removal

18、of fusion tag342. 真核表达载体包括质粒载体和病毒载体。质粒载体：结构包括： 1. 原核序列： coli中ori 、抗生素抗性基因（如Ampr ） 2. 真核表达组件：启动子、增强子、克隆位点、药物抗性基因（Neor）、终止信号和polyA加入的信号序列如：pcDNA3.1： CMV启动子、多克隆位点、原核细胞复制起始点、Amp抗性基因、Neo抗性基因、小牛生长激素polyA。35病毒载体：病毒载体有良好的转染效率和靶向性。 腺病毒载体： 逆转录病毒： 腺相关病毒载体： 存在问题： 重组的逆转录病毒不稳定，在病毒复制过程中外源基因易发生重排与丢失。36第三节 基因克隆的基本过程

19、基因克隆的基本过程主要应包括：目的基因的获取；基因载体的选择与构建；基因载体与目的基因的连接（构建DNA重组体）；DNA重组体导入受体细胞；含DNA重组体细胞（转化子）或菌落的筛选与鉴定。扩增或表达目的蛋白 37基因克隆的基本过程 载体目的基因重组DNA分子细菌转化扩增38一、目的基因的获取(一) 直接从基因组DNA中分离 (二) 化学合成法 (三) 逆转录法 (四) 聚合酶链反应 (五) 从基因文库中筛选获得 39二、基因载体的选择与制备 载体的选择与构建直接影响到基因克隆的成败。 一般应从目的基因、所用限制酶及受体菌（细一般应从目的基因、所用限制酶及受体菌（细胞）的特性综合考虑。胞）的特性

20、综合考虑。 40三、DNA重组体的构建（一）目的基因与基因载体的连接 1. 粘端连接法 2. 平端连接法 3. 人工接头连接法 4. 同聚物加尾连接法411. 1. 粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1) 同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2) 不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接42目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连同一限制酶的酶切：同一限制酶的酶切：43两个不同限制酶的酶切两个不同限制酶的酶切 ： 使目的使目的DNA按正确的方向插入按正确的方向插入442

21、. 平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端453. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。465 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A

22、)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体47四、重组DNA导入受体细胞细胞(细菌)处于容易接受外源DNA状态叫感受态(competence)。重组体导入重组体导入原核细胞原核细胞的过程称为的过程称为转化转化(transformation)，重组体导入重组体导入真核细胞真核细胞的过程称的过程称转染转染(transfection)，而由而由病毒载体病毒载体构建的重组体导入细胞构建的重组体导入细胞(细菌细菌)被称为被称为感感染

23、染(infection)。 常用的受体细胞包括： 原核细胞：大肠杆菌、芽孢杆菌及链霉菌等 真核细胞：酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞等 48真核细胞中介导基因转染方法（一）磷酸钙共沉淀法（二）脂质体法（三）DEAE-葡聚糖介导转染法 （四）电穿孔法 （五）显微注射法 49化学转化的简要步骤：（了解）取感受态细胞置于冰浴上融化。加入目的DNA，轻轻旋转以混匀内容物，在冰浴上放置30 min。从冰浴上取出离心管，立即置于42 水浴中热击60-90sec。取出离心管快速放置到冰浴中，使细胞冷却2-3 min。每管加500 l SOC或LB培养基，置于37摇床振摇培养，温育45 min使细胞复苏，以便表达

24、质粒编码的抗生素抗性标记基因。取100 l已转化的感受态细胞转移到含有相应抗生素的SOC或LB培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平板，于37 培养12-16 h。50五、筛选与鉴定 将重组体引入受体菌(细胞)，并经初步扩增后，应进行筛选，即从大量转化菌落或噬菌斑中选择和鉴定出含有目的基因的菌株(细胞)，这一过程就称为筛选(Screening)或选择(Selection)。 51（一）根据DNA重组体表型筛选 1.插入灭活法 2.-互补筛选法（二）限制酶酶谱分析法电泳（三）核酸分子杂交 （四）PCR扩增法 （五）核酸序列测定 （六）免疫学方法 筛选

25、与鉴定52四环素抗性基因（TcR）失活( (插入失活法插入失活法) )抗药性标记选择抗药性标记选择53 互互补补的的检检测测片段片段片段片段片段片段片段54第四节 克隆基因的表达一、克隆基因在原核细胞中的表达（一）真核基因在大肠杆菌中表达的基本要求（二）提高外源基因表达水平的方法二、克隆基因在真核细胞中的表达（一）酵母表达系统（二）哺乳动物细胞表达系统（三）哺乳动物细胞基因转染的筛选55（一）真核基因在大肠杆菌中表达的基本要求1.适当改造或选择真核基因。2.选用合适的表达载体（以大肠杆菌为宿主菌）。3.在大肠杆菌中表达。4.选择合适的诱导条件。561. 适当改造或选择真核基因：真核基因在原核细

26、胞中表达的基本条件:其 5端不能带有非编码区和内含子，故不能直接用基因组DNA，要用cDNA或化学合成的基因。外源基因必须置于原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件下游。外源基因与表达载体重组后，必须形成正确的开放阅读框架。外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并能被有效翻译，所表达蛋白质产物对宿主菌无毒害作用，且不易被宿主菌的蛋白酶降解。572. 选用以大肠杆菌为宿主菌的载体载体： 具有强启动子和两侧的调控序列，如trp-lac启动子，噬菌体 PL启动子，T7噬菌体启动子。受体菌：RB791、XL-1-blue、SB221、JM109，M5129菌株 含有多克隆位点多克隆位点，确保外源基因按

27、照正确的方向插入表达载体，且可译框保持不变。 带有转录终止序列转录终止序列，如不依赖p因子的转录终止区。 含有SD序列序列，且SD序列与ATG之间要有合适的距离。583. 在大肠杆菌中表达方式：分为：分泌型表达，融合表达，非融合表达。（1） 分泌型表达：表达的产物分泌到细胞外或培养液中，有利于形成蛋白质的正确结构。分泌型蛋白质可以是融合蛋白或非融合蛋白。优点：可防止宿主蛋白酶对表达蛋白的降解，减轻大肠杆菌的代谢负荷，便于蛋白质在细胞外正确折叠和提纯。但是，分泌型蛋白的表达量较低，信号肽不能被切除或被错误的切除。59非分泌型表达（2） 非融合表达：将目的基因连接在起始密码子之后，即在SD序列的下

28、游的适当位置构建一个Nde或Nco位点。表达非融合蛋白。非融合蛋白有类似天然蛋白质的结构，生物学功能接近体内天然蛋白质。缺点：容易被宿主蛋白酶水解。60（3） 融合表达融合表达：将目的基因与大肠杆菌的编码序列连在一起表达，N端由大肠杆菌基因片段编码，C端由外源基因编码，形成融合蛋白。采用6His 或 GSH转移酶(GST)为标签，分离纯化目的蛋白。优点： 融合表达比较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。 转录和翻译，从正常的大肠杆菌序列开始，表达效率高。 在胞内形成良好的空间构像，且大多具有水溶性。 可利用针对融合蛋白中的原核部分的单抗，进行亲和层析，便于分离纯化。 方便切除原核部分，释放出天然蛋白质

29、。 若携带的大肠杆菌片段含有信号肽，则可表达分泌型蛋白。61采用6His或GSH转移酶(GST)为标签，分离纯化目的蛋白。 目标蛋白与6xhis融合表达，然后利用固定化的镍进行纯化 将目标蛋白与GST融合表达，然后利用固定化的谷胱甘肽进行纯化。 可将裂解液直接加入到预装的谷胱甘肽琼脂糖柱中。经过洗柱去除样品中的非GST组分之后，使用还原性的谷胱甘肽即可洗脱得到纯的GST或GST融合蛋白。62包涵体：当大肠杆菌高效表达外源基因时，所表达的蛋白质致密地聚集在细胞内或被膜包裹，形成不溶性的结构，称为包涵体（inclusion body）。 包涵体有利于外源基因表达产物的分离纯化，在一定程度能保持表达

30、产物结构稳定，防止受细胞蛋白酶降解。 同时也使宿主细胞能够表达对其有害或有致死效应的目的蛋白。 但是包涵体要经过有效的复性操作，以获得天然有活性的目的蛋白。63包涵体蛋白分离纯化方法一般步骤: 破碎细胞，离心分离包涵体， 用1%Triton X-100或盐酸胍洗涤，去除吸附在包涵体表面的不溶性蛋白。 用高浓度的变性剂如810mol/L尿素或58mol/L盐酸胍溶解包涵体。 适当缓冲液透析，除去变性剂，使蛋白质在适当条件下重新折叠成有生物活性的蛋白质。 64二、克隆基因在真核细胞中表达（一）酵母表达系统 毕赤酵母，甲醇诱导。（二）哺乳动物细胞表达系统载体：含有原核克隆载体的复制子，抗性筛选基因，

31、MCS序列；又含有真核生物的启动子，增强子，剪接信号，转录终止信号，polyA信号，遗传选择标记等组件。65（三）哺乳动物细胞基因转染后的筛选 目前常用于筛选的基因有以下几种： 1. 新霉素抗性基因: 一般真核细胞不能在含G418的培养基中生长， 表达载体含有Neor基因编码的磷酸转移酶，能使G418失活。阳性细胞能存活。 该选择系统适合所有的真核细胞。 66 2. 胸苷激酶基因(thymidine kinase, TK） 胸苷激酶TK是dTTP补救合成的关键酶，TK细胞的培养基里外源的胸苷在胸苷激酶催化下合成dTTP，细胞存活。一般用TK细胞作为宿主细胞，将带有tk基因的载体导入细胞，筛选T

32、K细胞。3. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） 二氢叶酸还原酶催化FH2生成FH4，参与dUMP生成dTMP。以dhfr细胞作为受体细胞，只有导入重组载体的转染细胞(阳性克隆)才能在普通培养基上生长67（四）外源基因在真核细胞中的表达1.瞬时表达外源DNA不与宿主DNA整合，不能随宿主基因组复制而扩增，基因表达只能维持72 h以内，随着未转染细胞的大量扩增，少数转染细胞很快丢失。2.稳定表达外源基因整合到宿主染色体中，随宿主基因组复制、转录、翻译，持续表达外源蛋白，称稳定转染。 需利用标记基因进行筛选。68（一）疾病相关基因的分析与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。1.

33、定位克隆(positional cloning):它是指从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。 2. 功能性克隆（fuctional cloning）:它是指从一种致病基因功能的理解出发克隆该致病基因的方法。第五节 基因工程与医学的关系（二）生物制药69 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO, 酵母)预防乙肝70基因诊断基因诊断 (genetic diagnosis)（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA