SDS-PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹.

1、SDS 一 PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹蛋白免疫印迹杂交(Western Blot )是将 费白样木通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大 小分离，再转移到杂交膜(blot)上，然后 通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性 检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行 和成熟的技术之一。原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（AcC和交 联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂N, N, N，, W四甲基乙二胺（简称TEMED）和催化剂过 硫酸镀（简称AP）作用下聚合交联成三维网状结 构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙 烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。Proteins on blot separa

2、ted by sizeEpitope Tagged ProteinPxvtvin Blot oilNhrocellulowSDS Polyacr1anridv CM Elcctmplxrvislibwl witli Specific.AntibodyDtct AntibodyReveals Protein of Inumt30%丙烯酰胺的配制 1、称量Acrylamide290g, Bis10g,置于 1 L烧 杯中2、向烧杯中加入约600 m啲去离子水,充分搅 拌溶解。3、加去离子水将溶液定容至1 L,用0.45 mm滤 膜滤去杂质。 4.于棕色瓶中4C保存。注意:丙烯酰胶具有很强的神经毒性

3、，并可通过 皮肤吸收，英作川具有积累性，配制时应戴于套、 另蠶潺翳飜隸滤齋谨慎操作因凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切 相关。表3. 4 分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/ (%)20-3015-2010 -155-102-5500KI)分离般的聚合(佗) 5ml体系蒸IS水1.634ml30%丙烯故股2.0ml1.5MpH8.8Tris-SDS3.7ml10%AP25ulTEMED5ul上层加异丙醇压阪，室温一小W积层腹的聚舍(5%) 2.5ml体系1.75ml0.413ml0.338ml12.5ul2.5ul蒸谓水30%丙烯朋版1MpH6.8Tris-SDS10%

4、APTEMEDk弟施亠* 生一 PHJ6 7 Tm HQ 調寿 PHJ9S1HC1 喩圣葢 PHL83TmntBffl圈h=p:/202二 4 128248/newk=mwmoban2/indexHm*I:声IKm9*r 轿-SS3X0丰苓1 x 一 0 3尊X3I (吕y常蒔 -申5*茅活決9| 30 1（二）方法1、制胶：制备凝胶板,将混合后的分离胶溶液，丿Lhml枪加 至距梳齿卜缘约1 cmo IIJ1 mL枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻 轻加一层异肉醇（约高3-4 mm）,用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚含，则可看到水与凝固的胶而有折射率 不同的界线。将界内醉倒

5、去川巫蒸水洗净胶面，将混合均匀后的浓缩胶溶液 加入分离胶上方，轻轻插入梳子待上层胶聚合，拔出梳子，放 入电泳桝，加入电极缓冲液，使液而没过短玻璃板约0.3 cm,即 可加样。2、样品处理：样品经反复冻融裂解，离心，测浓度后，向样品中加入适量的 上样缓冲液6*SDS.金属浴105 C 10min,加样鼠一般何个样 品池 10401。3、电泳将电泳仪与屯源接通，打开电泳仪稳流，开始时电 流约20mA,待样品进入分离胶后，将电流调至25-30 mA,当漠酚蓝染料距底框0.5cm吋，停止电泳，关闭 电源4、染色与脱色电泳结束后，取卜凝胶板，用胶铲播开短玻璃板，丛 凝胶板上切卜 角作为加样标记。加入染色

6、液染色”2 h,再加自来水（加儿滴3MKCI）煮沸三次（10min/；X）脱色, 则可见蛋白质区带清晰。5、转移电泳：凝胶电泳结朿前30min,将PDVF膜浸泡 在转移缓冲液中。从模具中取出凝胶放在 PDVF膜上，驱除气泡，然后置于滤纸上 放入转移模具中，将模具放入转移电泳槽,PDVF膜一而朝正极，恒压100伏70min,4C电泳过夜，次口取出PDVF膜做好标 记。七、抗体杂交抗体衣而匸要采用间接法。即先加入木标记特 异性抗体与膜上抗原结合，再加入标记的抗体 进行杂交检测，标记二抗物质有放射性核索、 iW以及生物素等。杂交过程：1)封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体 稀释液稀释的一抗，封口，

7、4C孵育过夜或室温(22-25C)摇动孵育2h2 )液洗膜3次xIOmin3 )标记的二抗室温1h,洗膜3x10min八、检测根据标记二抗的标记物不同，其杂交的结果检测方法 也不同，较常用的检测系统仃増强化学发光(EGL)利 DAB检测系统.1)辣根过氧化物IW-DAB法： DAB显色液的配制:按照1mlH2 O加显色剂A,B,C 各1滴,混匀. 显色:将适量DAB显色液平舖在二抗朵交后的印迹 膜上,室温放置观察，可出现明显的棕褐色蛋白显色 带终il:JHTris-HCI缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止 反应.2)辣根过氧化物酶ECL法：増强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酚催化化 学发光

8、物质，生成一种不稳定的中间物质，瓦衰变时在 暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶 片感光原理，将结果记录下来。ECL显色剂配制：按EP管中加显色剂A、B各1滴,混匀， 在暗室将杂交后印迹月莫放入显色盒中，加上混合好的显 色液，反应15分钟，用纸山吸去印迹膜边缘或者边角 部分多余的显色液，将一透明的保鲜膜盖住抚平，并确 定干的表面与胶片接触。将卬迹膜喑室中使胶片眾光分钟，冲洗胶片以确定 所测抗原的正确暴光时间，暴光时间可短至几秒也可以 长到数小时。冲洗胶片步骤：先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或 者胶片透明为止，在放入定影液中漂洗，I秒即可。考马斯亮蓝和DAB考竹斯亮谥染色：将凝胶取

9、宙放入培并川1中加入少吊的染色液.以没没凝胶为1L 在摇床 上志荡，直到凝胶上出现明显的条带为止,一般56小时或者49过夜。然后倾去染色液，用脱色液洗涤底荡英间雯个断换脱色液，N至脱色 液顿色稍沾侥.凝胶行景淸楚为ilDAB显色常见问题及解决方案D帛見问题分祈与解决方雯礪 可能原因瀾不充分-抗侬啧过鬲缺孵1極过鬲二抗辅射谿咖胡咬农fi一抗址抗与封和碇叉殆ifcKTJE#JRK合适 限鞘鲨证或解决亦法b孰台适粧用刑（, bsa,血活寻） 脚ua曜.低溟呢讹c冷宣)腮殳有芫全均匀tS透使用100% meihanogiSS靶蛋缪理托马000融何径的IS，翻*1搁靶影等鮎等二或騎觴豁可尝试浇馳媛帼GC

10、Am( pH 10硕 诫3H1S裟冲赦乙驕冲液过鬲曰餌瓯度餌S3白吏与SD%m,从而沉画胁 丽空期胶收缩藪便 从耐能罔分子量証擠臥 话疑度或舌便用油対丙薛儁转移寸间不旷hick gel刃于融阪以殖笊量蛋鴿要廷长转耕搁1 r Jb WaJ |r*MbhW _ irenixcrwkr3,2Htr.brr1:5,000- 注意事项：1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统右关。内此，凝胶电 泳时的蛋白上样量丿该保证被检测抗原呈不至于太低, 如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次 梯度稀释，上样电泳后，直接考马斯亮蓝染色选择最 佳上样量。形成凝胶的试剂要令足够的纯度，激活剂的浓度适当, 不仅可以决立

11、凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量, 凝胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。凶此，建议 耍根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离 胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15 20分钟最佳，对于浓缩胶最佳聚合时间为810分钟 开始可见聚合。灌完分离胶加小封闭分离胶与外界氧 气的结合。2. 未聚合的内烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴于套 口罩防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，町将 梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产半，梳子拔出来时应 该小心，不要破坏加样孔，如令加样孔上的凝胶歪斜可 用针头插入加样孔中纠正，但要避免针头刺入胶内。3. 电泳硒内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的 气和未聚合的丙烯酰胺，同时建议低电压短时间的f贝11 泳，淸除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程 中电泳的畅通（恒压10-20V, 20-30min）5加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以 减少蛋白质沉淀堵塞胶孔。6.为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等械的样詁 缓冲液。7.样品缓冲液屮煮沸的样品可在七0C存放数 月，但是反复徐融会使蛋白质降解。8为减