第四章 沉淀分离

1、第四章第四章 沉淀分离沉淀分离背 景 分析化学分析化学氢氧化物沉淀：氢氧化物沉淀： Zn,Pb,Sn,Al离子离子 NH3H2O：Cu,Co,Ni,Cd, Hg, Ag离子离子氨络合物氨络合物金属离子： (Ag+)Cl-, (Ba2+) SO42-, (PbPb2+2+)CrO42-, (MgMg2+2+)PO43-, (CaCa2+2+)F- 沉淀(Precipitate)：在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体，从溶液中析出的过程。 A+B AB(沉淀沉淀) A+B B(沉析沉析)沉淀vs结晶 相同点：本质相同新相析出 区 别：形态不同沉淀：同类分子或离子以无规则的紊乱排列形式

2、析出结晶：同类分子或离子以有规则排列形式析出 沉淀分离：通过沉淀，在固液分相后，除去留在液相或沉积在固相中的非必要成分。 优点：过程简单，成本低 缺点：产品纯度低，过滤困难沉淀分离技术适用于蛋白质(酶)分离与提取 减小料液体积 提高目标产品的稳定性 有利于料液的后续处理内 容 第一节 蛋白质的溶解特性 第二节 蛋白质的沉淀方法第一节 蛋白质的溶解特性一、蛋白质的表面溶解特性 1. 亲水性与疏水性 2. 荷电性The red areas are negative charge (acidic residues), the blue are positive charge (basic resid

3、ues)3. 影响蛋白质溶解度的因素蛋白质性质蛋白质性质极性极性/非极性残基分布非极性残基分布溶剂可利用度溶剂可利用度分子大小氨基酸残基的化学性质pH氨基酸组成蛋白质结构离子强度氨基酸序列蛋白质电性温度可离子化残基数化学键性质极性/非极性残基比率溶液性质二、蛋白质的胶体稳定性 胶体(Colloid), 又称胶状分散体, 是一种均匀混合物，在胶体中含有两种不同状态的物质，一种分散，另一种连续。 胶体是一种高度分散的多相不均匀体系。1. 蛋白质之间的静电斥力 双电层(吸附层)2.蛋白质分子之间的吸引力 范德华力取向力诱导力色散力蛋白质分子之间吸引力和排斥力的相对大小决定着其溶解特性3. 蛋白质周围

4、的水化层 紧密结合水化层：0.35g/g蛋白 疏松结合水化层：2倍分子量第二节 蛋白质的沉淀方法一、盐析法 盐析盐析(salting-out)是指蛋白质(酶)在高离子强度溶液中溶解度降低，以致从溶液中沉淀出来的现象。 盐溶盐溶(salting-in)是指蛋白质(酶)在低盐浓度下的溶解度随着盐浓度升高而增加的现象。盐析vs盐溶1.盐析原理 生物大分子在水溶液中的存在状态两性电解质，由于静电力的作用，分子之间相 互排斥，形成稳定的分散系蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子， 避免了相互碰撞盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：(1) ”盐溶”现象低盐浓度下,蛋白质溶解度增大

5、(2) ”盐析”现象高盐浓度下,蛋白质溶解度随之下降 Ions from the salt associate with the surface of the protein. This shields those areas from the solvent molecules (water). In effect, this means that less water molecules are required to interact with the protein surface and the concentration of free water is increased. We

6、 say that the activity of the water has increased. The net effect is that the protein becomes more soluble.All the binding sites on the protein surface for the salt ions have become occupied and so the ions begin to interact with the solvent. The concentration of free solvent molecules decreases as

7、they are used to solvate the salt ions. Protein molecules therefore move closer together and begin to interact with one another via the hydrophobic or charged patches on their surfaces. At some salt concentration (which depends on the salt and the size/charge characteristics of the protein), the pro

8、tein molecules aggregate and come out of solution. 盐析原理无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱排斥力减弱，从而能够相互靠拢；中性盐的疏水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。2. 盐析方式Cohn 公式 logS=-KsI S为蛋白质溶解度,mol/L; 为蛋白质在纯水中溶解度的对数值,与蛋白质种类、温度和pH值有关,与盐无关； Ks为盐析常数,与蛋白质和无机盐的种类有关,与温度和pH值无关； I为离子强度, I=2CiZi2, Ci为离子浓度,

9、mol/L; Zi为离子电荷数。 Ks分级盐析法 在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法。该方法由于蛋白质对离子强度的变化极敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于蛋白质的粗提取。 分级盐析法 在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析的方法。由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率高，常用于蛋白质的进一步纯化。分步盐析纤维蛋白原拟球蛋白血清白蛋白C肌红蛋白血红蛋白盐析剂的选择 在相同的离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为： 半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁选用盐析剂的几点考虑盐析作用强溶解度大惰性

10、强来源丰富，成本低常用盐析剂硫酸铵硫酸铵硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐影响盐析的因素 (1)蛋白质的种类Ks和值 (2)蛋白质的原始浓度浓度高，盐用量小，但共沉作用明显，分辨率低；浓度低，盐用量大，分辨率高 (3)离子强度 (3)离子类型 (4)温度和pH高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降通常调整体系pH值，使其在pI附近 (5)盐的加入方式固体/饱和溶液盐析用盐量的选择 饱和度(Saturation)以硫酸铵为例：20时，硫酸铵的饱和溶解度是534g/L定义为100%饱和度。其他盐析操作形式 透析盐析将蛋白质溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使蛋白质

11、发生沉淀。 反抽提法盐析先一次性将多种蛋白质一起沉淀出来，再选择适当的递减浓度的盐来抽提沉淀物。3. 脱 盐 透析DialysisExchange buffer 3 times 纳滤 凝胶过滤二、有机溶剂沉淀法 在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。原 理（1）降低了溶质的介电常数介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。选择有机溶剂的几点考虑 （1）介电常数要小，沉淀作用强 （2）致变性作用小 （3）毒性小，挥

12、发性适中 （4）水溶性好常用的有机溶剂 乙醇沉淀作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉淀 丙酮沉淀作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广介电常数小，60%乙醇为48，而100%丙酮为22有机溶剂沉淀的特点 分辨率高； 溶剂容易分离，并可回收使用 产品洁净 容易使蛋白质等生物大分子失活应注意在低温下操作 成本高主要影响因素 温度 低温有利于防止溶质变性; 有利于提高收率（溶解度下降） 溶液pH避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象 离子强度低离子强度有利于有机溶剂沉淀，10-50mM 蛋白浓度0.53%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉作用小浓：节省溶剂用量，

13、但共沉作用强，分辨率低 金属离子Zn2+、Ca2+有利于沉淀析出。 搅拌利于散热三、等电点沉淀 概念调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，以致沉淀析出的操作，称为等电点沉淀。原理 蛋白质是两性电解质，但溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子之间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。注意事项 （1）由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解 度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收 率。因此，等电点沉淀法通常与盐析、 有机溶剂沉淀法联合使用 （2）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常 会发生“漂移”。（阳-高，阴-低） （3）溶质的稳定性 （4）盐析效

14、应四、其他沉淀方法 非离子多聚物沉淀法 变性沉淀法 成盐类复合物沉淀法 亲和沉淀法4.1 非离子多聚物沉淀法 This form of precipitation involves the addition of a non-ionic polymer to the protein solution. This works because the addition of the polymer reduces the amount of water available to interact with the protein. The polymers that have recieved the most attention have been dextrans (葡聚糖) and polyethylene glycols (聚乙二醇).4.2 变性沉淀法 利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。加入变性剂选择性热变性选择性酸碱变性 注意：使用时需慎重！4.3 成盐类复合物沉淀法 此沉淀法有三类沉淀剂：(1)高价金属盐：Cu2+、Ag+、Zn2+、Ca2+