免疫组化SP法与SABC

1、免疫组化SP法与SABCABC法: ABC弋表的是亲和素一生物素一过氧化物酶复合物。 利用抗生物素分 别 连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。但是此法注意内源性生物素活性 的消除，以减少非特异性的染色。SP法：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶 及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。PA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，它能与各种动物的IGG的FC段结合，在免疫组化中可作为桥 抗体或标记抗体。最大的优点是不受种属的特异性限制。此法还具有染色时间短、灵敏度高、背景染色淡等优点，分子量小，易于穿透组织。两者本质的区别是：SABC法的“三抗”是SABC复合物

2、即链酶亲和素-生物素 -过氧化物酶复合物；而SP法的“三抗”是过氧化物酶直接与链酶 亲和素相 连的，没有通过生物素的中介连接。SABC步骤:切片常规脱蜡、脱 水；30% H2O2H蒸馏水10份混合，室温5- 10分钟以灭活 内源性酶，蒸馏水洗；将切片浸入 0.01M枸橼酸盐(PH6.0)，微波炉加热至沸 腾后断 电，间隔10分钟，反复两次进行热修复抗原；滴加 5% BSA封闭液，室温20分钟；滴加一抗，37C1小时30分钟孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温下20分钟，PBS( PH7.2-7.6 )洗；滴加试剂 SABC室温下20分钟，PBS洗5分钟X4次；DAB显色：取1ml蒸馏水，加

3、试剂盒中A，B, C试剂各1滴, 混匀后加至切片，室温显色18分钟；苏木素轻度复染；脱水，透明封片。显微 镜下观察。免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、 定量测定的一项新技术。免疫组织化学的方法有多种，其实都大同小异，不同 点只是在于显色基团！SP法1) 脱蜡、水化;2) PBS洗23次各5分钟;3) 3%HO (80和醇)滴加在TMAh，室温静置10分钟;4) PBS洗23次各5分钟；5) 抗原修复；6) PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温 20分钟。甩去多余液体。8）

4、滴加I抗50卩l，室温静置1小时或者4C过夜或者37C1小时。9）4C过夜后需在37E复温45分钟。10）PBS洗 3次各5分钟；11）滴加U抗4050卩I，室温静置，或37C1小时；12）II 抗中可加入 0.05%的 tween-20。13）PBS洗 3次各5分钟；14）DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗1015分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC法1）脱蜡、水化。2）PBS洗两次各5分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%HO，室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）P

5、BS洗 5 分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温 20分钟。甩去多余液体。7）滴加I抗，室温1小时或者4C过夜或者37C1小时（4C过夜后在37C复 温45分钟）。8）PBS洗三次每次2分钟。9）滴加生物素化二抗，20r37r 20分钟。10）PBC洗 3次每次2分钟。11）滴加试剂SABC 20r37r 20分钟。12）PBS洗 4次每次5分钟。13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15）脱水、透明、封片、镜检。二者区别:sp法是：一抗+生物素化二抗+ HRP标记的链霉卵白素（HRP标记的亲和素）酶标亲和素

6、-生物素技术（labelled avidin-biotintechnique，简称LAB法）。即用辣根过氧化物酶直接标记 avid in，用biot in标记2抗。关键步骤为3步：Ag +Ab1 +（ Ab2-B）+A（A为HRF标记的卵白素）A与2抗的生物素结合，avid in起桥联作用。如 将该法中的卵白素（avidin ）变换成链霉卵白素 （streptavidin ），LAB法即 成LsAB法，或称SP法。据认为LAB法比ABC法敏感24倍，而LsAB法因streptavidin不与组织细胞中内源性生物素结合而 特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。sabc法是：一抗+生

7、物素化二抗+ abc复合物（是使用前亲和素与酶联生物素 现配使用）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（avidin-biotin-peroxidase complex technique，简称 ABC法）。关键的程序步骤为3步：Ag +Ab1 + （Ab2-B） +AB C 复合物（Ab2-B为生物素标记的第二抗体）（B 为生物素标记的过氧化物酶）ABC 复合物是avid in 与酶联biot in 1比1在使用前30min配置，混匀。1个avid in 分子结合了 3个biot in分子，剩下1个结合点与2抗的生物素结合，avid in起 桥联作用。ABC法敏感性更高，比PAP法敏感204

8、0倍，背景也更清晰。个人理解：SP法和SABC法相差不大，一般都可以用.SP法:一抗+生物素标记二抗+辣根酶标记链霉卵白素+辣根酶底物显色SAB（法:一抗+生物素标记二抗+滴加试剂SABC链霉卵白素+辣根酶标记生物素）+辣 根酶底物显色比较可知，SABC法 SP法在原理上基本是一样的。但由于 SAB（法第3步有放大 作用，所以更灵敏一些.可能会出现用SABC法可以做出结果的，用SP法做不出 来.总的来说，个人认为SABC法可能好一些！我自己以及周围的同学以前一般 都是选用SABC法！SP法1脱蜡水化2蒸馏水中5分钟3用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封 闭10分钟蒸馏水洗1次4抗原修复

9、5PBS洗5分钟6滴加正常山羊血清封闭液，室温10分钟7甩去多余液体滴加1抗37度1小时或者4过 夜4过夜后37复温45分钟8PBS洗2次各5分钟9滴加生物素化抗孵育条件参见所用试剂盒10PBS11滴加酶标抗体孵育条件参见所用试剂盒12PBS洗2次各5分钟13DAB显色510分钟在显微镜下掌握染色程度14蒸馏水洗终止染色苏木素复染盐酸酒精分化15脱水透明封片镜检洗2次各5分钟SABC 法1脱蜡水化2蒸馏水中5分钟3用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封 闭5-10分钟蒸馏水洗1次4抗原修复5PBS洗5分钟6滴加正常山羊血清封闭液室温 10-20分钟甩去 多余液体7滴加1抗,37度1小时或者4过夜4过夜后在37复温30分钟8PBS洗2次每次5分钟9滴加生物素化二抗孵育条件参见所用试剂盒10PBC洗2次每次5分钟11滴加试剂SABC孵育条件参见所用试剂盒12PBS洗2次每次5分钟