酶免检测技术影响ppt课件

1、酶免检测技术影响要素酶免检测技术影响要素n酶免技术的分类酶免技术的分类n实验本卷须知实验本卷须知n实验中常见问题及处理方法实验中常见问题及处理方法 均相法 双抗原夹心法测抗体 直接法 双抗体夹心法测抗原 酶免法 间接法 测抗体、抗原 EIA 非均相法 ELISA 竞相法 测抗体、抗原 捕获法 测IgM抗体enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定法 酶免技术的分类酶免技术的分类n双抗体夹心法n HBsAg、 HBeAgn双抗原夹心法n HBsAb夹心法夹心法nHBcAb、 HBeAb竞争法竞争法nHDV IgG/M、 HEV IgG/Mn 测IgG 测

2、IgM间接法间接法nHAV-IgM捕获法测捕获法测IgM实验本卷须知实验本卷须知1、标本、标本防止溶血防止溶血尽量新颖，防止细菌污染尽量新颖，防止细菌污染 普通普通5天内检测的血清可天内检测的血清可4保管，否那么低保管，否那么低温保管。温保管。 2、试剂、试剂运用前平衡至室温运用前平衡至室温配置洗液应运用去离子水或蒸馏水，保证水配置洗液应运用去离子水或蒸馏水，保证水的新颖的新颖3、设计实验、设计实验设计好孔位，通常阴阳对照孔各设计好孔位，通常阴阳对照孔各2孔、空白孔、空白1孔。孔。 必要时做好标注，防止错误必要时做好标注，防止错误4、加样、加样样品应全部加于反响孔底部，防止液体悬挂样品应全部加

3、于反响孔底部，防止液体悬挂在孔壁上。在孔壁上。加样量准确！加样量准确！加下一标本时改换吸嘴加下一标本时改换吸嘴5、加酶结合物、加酶结合物普通运用滴瓶滴加普通运用滴瓶滴加滴加时应坚持瓶身垂直、加液速度适中，使滴加时应坚持瓶身垂直、加液速度适中，使液滴大小均匀一致液滴大小均匀一致一步法时先加样本后加酶，不可颠倒顺序一步法时先加样本后加酶，不可颠倒顺序普通空白孔只加底物和终止液，而不能参与普通空白孔只加底物和终止液，而不能参与其它物质，尤其是酶结合物其它物质，尤其是酶结合物6、温育温度、时间要严厉控制！最好使反响杯尽快升温到所需温度最好放入湿盒或水浴箱中反响板贴上即时贴 微孔板放入水浴箱后，孔内温度

4、上升到37需求一定时间。但实践任务中很少有人留意这个问题，通常是放入即计时，导致实践温育时间不够，弱阳性标本漏检。 处理：微孔板放水面上或湿盒中纱布浸透水，使板底部直接与37接触，迅速到达温度。7、洗板、洗板运用公用洗涤液运用公用洗涤液普通洗涤普通洗涤46次次假设手工洗涤，假设手工洗涤， 前两次洗涤应不溢出反响孔前两次洗涤应不溢出反响孔 污染污染 后面几次洗涤应加满一切孔后面几次洗涤应加满一切孔 干净干净每次加洗涤液后应浸泡每次加洗涤液后应浸泡30秒再甩去洗液秒再甩去洗液反响板倒扣吸水纸上拍干反响板倒扣吸水纸上拍干洗板时应留意非离子去垢剂的浓度。洗液中洗板时应留意非离子去垢剂的浓度。洗液中Tw

5、een20高于高于0.2%,可使包被子固相上的抗体可使包被子固相上的抗体抗原解吸附而影响测定下限。抗原解吸附而影响测定下限。8、加底物、加底物底物底物A液通常是液通常是H2O2 复原剂复原剂底物底物B液通常是液通常是TMB3、3、5、5 -四甲基四甲基联苯胺联苯胺 氧化剂氧化剂TMB氧化后呈蓝色，被氧化后呈蓝色，被2N H2SO4 终止后呈终止后呈黄色，黄色，450nm波优点有最大吸收峰波优点有最大吸收峰底物底物B应避光保管，实验时加完底物应避光保管，实验时加完底物A、B保保温时也应避光保管。温时也应避光保管。9、比色、比色空白孔校零，读取各孔空白孔校零，读取各孔OD值值单波长单波长or双波长

6、的选择：双波长的选择： 单波长通常是对显色具有最大吸收的单波长通常是对显色具有最大吸收的450nm或或492nm 双波长酶标仪那么在敏感波长双波长酶标仪那么在敏感波长450nm和非敏感波长和非敏感波长630nm下各测定一次。运用下各测定一次。运用双波长时不用设定空白孔，否那么会呵斥双波长时不用设定空白孔，否那么会呵斥孔吸光度数为负数。孔吸光度数为负数。假设底物为假设底物为OPD邻苯二胺，波长为邻苯二胺，波长为492nm 假设底物为假设底物为TMB， 波长为波长为450nm10、结果判读、结果判读不同试剂，不同试剂，CUTOFF值计算方法不同值计算方法不同项目CUTOFF阳性判断HBsAb HB

7、eAg 阴性OD *2.1cutHBeAb（阴性OD+阳性OD）*0.5cutHBcAb稀释样品 阴性OD *0.5未稀释样品 阴性OD*0.3cut常见问题及处理方法常见问题及处理方法内源性标本要素：内源性标本要素：1、类风湿因子：普通为、类风湿因子：普通为IgM型，可与变性型，可与变性IgG Fc段非特异段非特异结合，因此能够与包被的结合，因此能够与包被的IgG以及随后参与的酶标以及随后参与的酶标IgG结合结合而产生假阳性。而产生假阳性。2、补体：包被抗体及随后参与的酶标抗体均能激活补体而、补体：包被抗体及随后参与的酶标抗体均能激活补体而与补体与补体C1q位点结合而产生假阳性，也可降低检测

8、物与固位点结合而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低相结合而引起假阴性或测值偏低3、异嗜性抗体：人血清中含有抗、异嗜性抗体：人血清中含有抗 齿类动物羊、鼠等齿类动物羊、鼠等Ig的抗体，即天然异嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。的抗体，即天然异嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。4、溶菌酶：可与等电点、溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法夹心法ELISA可假阳性。可假阳性。外源性标本要素：外源性标本要素：1、溶血：、溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温育时吸附固相可与育时吸附固相可与H

9、RP显色。显色。2、细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或、细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或直接影响酶标抗体作用，并且细菌引起标本混浊。直接影响酶标抗体作用，并且细菌引起标本混浊。3、标本、标本4存放过久：存放过久：IgG聚合成二聚体，间接法中易假聚合成二聚体，间接法中易假阳性。建议阳性。建议1:201:20准确配置洗涤液1010、试剂盒运输时间太长，受高温影响、试剂盒运输时间太长，受高温影响夏天长途运输时，缩短时间，低温措施1111、试剂盒失效、试剂盒失效不适用失效试剂现象可能原因解决方法重重复复性性差差1 1、样品数量较多、加样时间过长、样品数量较多、加样时间过长

10、重复测定标本时，尽可能使用同一移液器，装紧吸嘴，条件、人员应尽量与上次保持一致，以排除这些因素造成的重复性差的可能性。2 2、加样量不一致、加样量不一致3 3、孵育时间不一致、孵育时间不一致4 4、洗涤条件不同、洗涤条件不同5 5、操作人员不同、操作人员不同满板满板白，白，阳性阳性对照对照不显不显色色1 1、把终止液误当作酶结合物、或、把终止液误当作酶结合物、或底物使用底物使用严格按试剂说明书操作，加液时看准标签，正确稀释洗涤液，不要漏加试剂2 2、漏加试剂，如酶结合物、底物、漏加试剂，如酶结合物、底物A A、B B液液3 3、蒸馏水被污染，或盛洗涤液桶、蒸馏水被污染，或盛洗涤液桶被污染，留有使酶失活的物质被污染，留有使酶失活的物质换用合格水盛蒸馏水的瓶子要洁净现象可能原因解决方法满满板板显显色色1、底物失效、或被污染更换底物2、加好底物后在保温时，受强光或紫外线照射显色时避光保温3、反应时间过长准确定时4、水浴箱温度过高调准水浴箱温度5、加酶量过多，50ul误当100ul. 丙肝酶稀释时加量过多加液量、稀释要准确6、该批样品放置时间过长，样品