植物生理学中各项生理指标的测定方法

1、植物生理学中各项生理指标的测定方法. 实验内容1 MDA（ 丙二醛 ） 含量测定所需试剂：10无氯乙酸（TCA （纯）0.25%硫代巴妥酸纯）2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-25095% 乙醇 85%磷酸实验3: SOD®氧化物歧化酶）酶活性测定所需试剂：dl- 甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2核实验4: CAT过氧化氢酶）活性（过氧化氢酶）测定所需 试剂：PBS（PH=7.0）30% H2O2实验五：Apx （抗坏血酸过氧化物酶）活性（即ASA-POD舌性）测定所需试剂：ASA（ 分子量167.12 ） （ 乙 =胺四乙酸二 钠 ） EDTA- Na2PB

2、S（pH7.0） 30%H2O实验6: ASA（维生素C）含量测定偏磷酸 95% 乙醇 磷酸 4% 2,2- 二联吡啶FeCI3 （或 FeCI3 ? 6H2O实验7: GSH?胱甘肽,媚力肽GSH GS灌由谷氨酸、 半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物） 含量测定所需试剂：NaH2PO4 2H2O DTN B二硫代硝基苯甲酸）PBS （ PH6.8）实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸 甲苯茚三酮冰乙酸85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。80%丙酮试验9: GF活性测定试验10：过氧化氢含量测定。三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二酶液和母液提取1 .酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸

3、缓冲液（PH=7.8）（内含 1% （ m/v） 聚 乙 烯 吡 哆 烷 酮 PVP），O.lmmol/LEDTAN戴 EDTA也可为（内含 2% （m/v） PVP , 0.2mmol/L EDTA Na或EDTA （先配制后用缓冲液定容）2 . ASA . GSH 母液提取所需试剂：5%偏磷酸1抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CA： T1g （根据样品的量，少的可以适当减少）叶片加入预冷5mL50mmol/L 磷酸缓冲液（PH=7.8）C冷冻15000g离心20分钟上清液即为酶液（5c下保存一两天内备用，中短期用-20 C保存）2. ASA . GSH母液提取：0.1g 叶片加入3ml

4、预冷5%偏磷酸溶液4c冷冻14000g离心10分钟5 °C 下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护AS酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯叱哆烷酮）：1%（ 1g溶于100ml水），1000ml 需称取10g,此 处用PBSEDTA-Na: 0.1mmol/L （37.2mg EDTA-Na容 于 1000ml 蒸 馏水 ） ，此处 用 PBSPBS（缓冲液）配制方法： NaHPO4 12H2C© NaHPO4 ? 2H2O取71.64g,蒸偏水定容至 1L,取31.21g定 容至1L, 放置4C冰箱备用PH=7.8 取 91.5ml+ 8.5ml=100ml （ 浓 度

5、0.2mol/L ）0.05mol/L f 将上述溶液烯释至400ml（0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g 纯偏磷酸，定容至100 ml 蒸馏水（需加热50-60C） 偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPQF以需称65.7895g,定容至500ml）三实验步骤实验1: MD给量测定1.1 所需试剂：10花氯乙酸（TCA （纯）称10g定容至 100ml0.25%硫代巴妥酸（ 纯 ）称0.25g 用 10%TC能容至 100ml（配制时，可一次完成，先配 TC必要定容，再加入硫

6、 代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2 步骤：取0.3g 叶片，加4ml 磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25% 的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液J 摇匀95 °C 加热 15 分钟J 快速冷却3000g 离心 15 分钟取上清测定OD532 ， OD600 ， OD450 值按公式求 MDA浓度=6.45 X （OD2-OD。）-0.56OD45（P mol/L）可溶性糖浓度 =11.71 X。函（mmol/L） 最后计算 MDA含量（P mol/g FW） = 4X（ MDA浓度 x） X 103/0.1同时，可测得可溶性糖含量（m mol/

7、g FW）= 4 X（可溶性糖浓度x） X 10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MD给量测定的改进1 .可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MD给量，用量可以定为1.0、1.5或2.0 （较好）ml。2 .硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代巴比妥酸（溶于 20%的三氯 乙酸）溶液。实验2:可溶性蛋白含量（参照Bradford方法测定），以BSA作为标准蛋白（牛血清蛋白）2.1 所需试剂及配制：牛血清蛋白（BSA考马斯亮蓝G-250, 95%噌享，85嫡酸考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂的配制：

8、称取100m弗马斯亮蓝G-250,溶于50ml 95%L醇，加入 100ml 85%的磷酸，最后蒸偏水定容到 1L,混匀， 放置过夜， 过滤后贮放在棕色瓶中，常温下可放置一个月。?标准曲线制作： 标准溶液配制：称取10mg牛血清蛋白标准液，溶于蒸储水， 定容至100ml,制成100 P g/ml的标准液，4° C下保存备用。（必须是牛血清蛋白向水中溶解，不能颠倒） 取6支具塞试管（10ml）,按下表配制含0-100 P g/ml的 牛血清蛋白液各1ml （调零管） 123456蛋白标准 液（ml）00.20.40.60.81.0蒸储水（ml）1.00.80.60.40.2020406

9、080100（g）各试管加入5ml G-250染色剂，翻转混合，放 置2分 钟595nm比色，绘制过原点标准曲线（方程式）。（相 关系数要两个9以上）2.2步骤： 标准曲线（参考邹琦）（595nm比色）注意：制作通过原点的标准曲线，以含 0 P g蛋白质液调零 取0.1g样品，力口 5ml蒸偏水提取，5000g离心10分钟，取 上清1ml测定1ml样液+5ml G-250液盖塞翻转混合数次，最后595nm比色， 直接从标准曲线读含量。（此方法反应十分迅速，2分钟即达到平衡，其结合物 在室温 下1小时内保持稳定）实验3: SOD!活性3.1步骤：1 .取50 口 l酶液 加入2ml 39m mo

10、l/L甲硫氨酸（Met） 2ml 0.225m mol/L NBT , （氮蓝四唾）1ml 0.6m mol/L EDTA-Na ?（ 可以配制在一个 试齐ij 瓶里）1ml 0.012m mol/L 核黄素，摇匀。（现配现用）2. （人工培养箱内）4000Lx 日光灯下放置30 分钟后，温度控制在30°C ，于暗处终止反应。（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔5min 转过 90 度，转四次。对照（不加酶液）每次至少对称地放 3 支，调零的不照光和不加酶液）3. 560nm处测吸光值，酶活性以抑制 NBT光反应50渤一个酶 活单位表示。（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂

11、按比例混合好后，一次加入5ml,然后依次加入核黄素和酶液，以不加酶液的照光管为对照。）_3.2 所需试剂：dl- 甲硫氨酸（Met）39mmol/L 1.1638g/g00ml 以 NBT0.225mmol/L（ 0.01840 均克 ） / 100ml0.0368g/200mlEDTA-Na 0.6mmol/L 0.0223g/100ml核黄素0.012mmol/L0.0045g/L 或0.0045g/100ml 用时稀释10倍各试剂溶液均在用前配置，配置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。试验进行时一次性加5ml 的反应混合液配置方法：Met + NBT + EDTA-

12、Na2SOC酶测定时，酶液量 50 P l偏少，改为100 P l为佳, 200mll+200ml+100ml另外反应时间30 分钟过长，改为20 分钟适合SO席性（酶单位 u/gFW = （A0-A1） *V / A0*0.5*FW*aA0- 对照照光管光吸收值；A1- 样品管光吸收值。V- 样 液总 体积 （ ml） 5mlFW- 鲜 重（g）1ga- 测定用样品的量（ml）0.1ml实验4: CAT活性（过氧化氢酶）4.1 所需试剂： PB（ S PH=7.0） 50mmol/L （ 61 份 50mmol/l Na 2HPO4, 39 份 50mmol/l NaH 2PO4 ） 15m

13、mol/L "0 （以 30% HQ配）（取 85.2 P L 30% HQ,以 50mmol/L PBS（ （PH7.0）定容至100ml）4.2 步骤 :1. 3ml 50mmol/L PBS （PH7.0）力口入 50 P l 酶液（加比色杯的盖子摇2-3 下，让酶液与缓冲液充分分散）再加入5 l 15 mmol/L H 2Q摇匀（加比色杯的盖子摇 2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。2. 240nm处作时间才3描（每0.5分钟测1次，共测3分钟）3. CAT活性以每分钟消耗1 P mol的HO为一个酶活单位。活性计算改动：（以每分钟OD直减少0.01为一个酶活 单位u）（20

14、05和2006年均是按 ODfi减少0.01算的）（以每分钟ODS减少0.1为一个酶活单位u）注意：以PBS乍空白调零50mmol/L实验5: APX活性（抗坏血酸过氧化物酶）（即ASA-POD性）5.1 所需试剂：ASA （分子量 167.12 ） 0.3m mol=0.052836 （g）（乙=胺四乙 酸=钠）EDTAr Na2 （以 PBS配 成 0.1m mol/L=0.0372（ g） /L ）50m mol/L PBS （ pH7.0）9m mol/L H 2Q （以 30%bD配制）（51 P l 30%H 2Q 定容至 100ml）计算为：K1=2.8, K2=3, K3=-1

15、, K4=100可得至U总取样（5ml酶液或1g样）的最终活性。酶活性 单位为口 mol/g （鲜重）? min以后APX活性测定可参考沈文巡：抗坏血酸过氧化 物酶活 性测定的探讨3 ml 反应液中含50 mmol/L PBS, pH7. 0, 0. 1 mmol/L EDTA（ 或 EDTA-Na2），0. 1 mmol/L H2O2 0. 5 （ 或 0.3） mmol/LAsA最后加入适量酶液（20、50、100ul均可） 启动反应，连 续记录测定室温下 290 nm吸收值的变化。以不加H2O2乍为 对照，H2O瘁身对AsA的氧化作用在 测定时间内由于吸收值变 化太小可忽略不计。室温下每

16、 分钟氧化1 umolAsA的酶量作为 一个酶活性单位（ U）（吸 光系数为2. 8 mmol/L cm ）5.2 步骤：1 . 配反应液（50m mol/L PBS（ pH7.0），内含 0.1m mol/LEDTA-Na2含 0.3m mol/L ASA ）2 .样品池加入3ml反应液，加入50 P l酶液，最后加入 5 P l 9mmol/L H2O2（ 盖上比色杯的盖子摇匀，2- 3 次 ）在290nm处作时间才3描，每10秒测一次，共测30秒。（注意：在测定中消光值应该是不断减小的）3 .根据OD值变化，计算单位时间内 AsA消耗量，（ASA氧 化消耗量按消光系数 2.8mmol/L

17、? cni ,酶活性以单位时间每 消耗1 it mol的ASA为一个酶活单位，最后计 算样品的APX活性（单位为：U/g （ 鲜重 ） ? min）。（活性计算改动）根据 OD29值变化，计算单位时间内AsA减少量（ASAK化量按消光系2.8mmol/L? crnj），并计算样 品APX终活性。酶活性单位为t mol/g （ 鲜重 ） ? min实验 6 ASA 含量测定6.1 步骤：（1） 取样品母液0.2ml, 1.4ml， 75mmol/l NaH2PO4 溶液 （ pH值 7.4 ）（2.34g NaH2PO4 ? 2H2淀容至 200ml,用 NaOK pH 调至 7.4）混合；（7

18、5mmol/l NaH2PO4§液亦 可用150mmol/l NaH2PO4溶液稀释1倍得到）（2） 依次加入（3） 10%偏磷酸（26.3158g 38%偏磷酸定容至100ml）0.4ml;（4） 44%磷酸（26ml 85%磷酸+41ml 蒸馏水）0.4ml;（5） 4% 2,2 ' - 二联吡啶（称取 4.0 g 2,2- 二联吡啶用70%酒精定容至100ml ） 0.4ml;70%酒精配制（95%乙醇70 份重量+蒸馏水25 份重量）3%FeCI3 0.2ml （称取 5.0g FeCI3 ? 6H2O定容至 100ml）, 摇匀，于37° C保温1.0h

19、（5）测525nm波长下 的光吸收值 4.以标准曲线方程计算 ASA含量6.2 标准曲线的制作：（1）称取10mgAS汾析纯，以5姗磷酸定容至100ml,成100微克/毫升的标准液；(2)按下表取8支试管，按照表中的程序加液j式管编 勺12345678标准液(ml)00.02 0).04 0.060.08 ().10 0.12 0.145%?偏磷酸(ml)0.20 0).18 0.16 0.140.12 ().10 0.08 0.06AS给 k (微02468101214按前面步骤1、2所述依次加入各反应液，最后测 525nm长下 的光吸收值，作过原点标准曲线，求线性方程。实验7: GSFW量

20、测定7.1步骤：1 .取样品母液 0.2ml ,加入 150 mmol/L NaH2PO希液(pH7.7)(11.70g NaH2PO4 2H2Cfe容至 500ml 用氢氧化钠调pH至7.7 ) 2.6ml2 .混匀再加入0.2ml DTNEB§« (二硫代硝基苯甲酸 DTNB75.3mg 溶于30ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液pH6.8 )摇匀。实际配置 时，称 75.3 X 2=150.6mg,即 0.1506g DTNB§于 60ml PBS中3 .在30° C保温5分钟，测定412nm波长下的光吸收值。【有些文献(如龚吉蕊、於丙军)方法同样

21、用DTNBS色，都是在常温下显色 30分钟因此可将反应时间适 当延长至10分钟】7.2根据标准曲线（GSH程，计算GS哈量。标准曲线制作：1.称取100mgGSH析纯，以5姗磷酸定容至100mL成1mg/ml 即1000ug/ml的标准液。2.参照实验6标液方法。1 式管编12345678，准液1（ml）00.02 0).04 0.060.08 ().10 0.12 0.145%偏磷(ml)0.20 0).18 0.16 0.140.12 ().10 0.08 0.06GSH版克）X02468101214正确GSI含量（微k）0H204060801001201403.以GSH量为0的溶液调零，

22、制作过原点标准曲线（及 方程 所需试剂：NaH2PO4 150m mol/L ）人称 23.41g NaH2PO4 2H2O定容至1L （或称5.85定容至250ml）DTNB（二硫代硝基苯甲酸）0.1mol/L PBS （PH6.8）（参 照邹 琦的书 实验8脯氨酸测定 8.1步骤：1.取0.5g叶片，用5ml 3%磺基水扬酸溶液提取，匀浆 液在沸水浴浸提10分钟，冷却后，以3000g离心10分 钟，上清液待 测。2.取2ml待测液，加入2ml蒸储水，再加入2ml冰乙酸 和4ml 2.5% 功三酮溶液，置沸水溶显色 60min,冷却后， 加入4ml甲苯充 分振荡提取红色物后，静置后，取甲苯相（将移液枪的量程调至3.0ml吸取甲苯相，注意不要 将枪伸到水相中。）测定520nm波 长处的吸收值，依据 标准曲线计算含量。8.2标准曲线制作：1 .标准液配制；准确称取 25mg脯氨酸，用蒸储水溶解 后定容 至250ml,其浓度为100 P g/ml ,再取10 ml此 液，蒸储水定 容至100ml,即为10 口 g? ml-1的脯氨酸标准液。（脯氨酸标准 液最好现用现配，放在冰箱也易变 性）2 .取7支20ml具塞试管按下表加入各试剂1标准脯氨酸 0（ml）