动物细胞细胞工程

1、动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植技术核移植技术动物细胞工程常用技术一、动物细胞培养一、动物细胞培养动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶1010代细胞代细胞原代培养原代培养5050代细胞代细胞传代培养传代培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系遗传物质遗传物质改变改变遗传物质未遗传物质未改变改变1 1、过程(取材取材)有关概念解读有关概念解读原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第第1 1代代细胞与细胞与传传1010代代以内以内的细胞称为原代细

2、胞培养。的细胞称为原代细胞培养。传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。细胞株：原代细胞一般传至1010代左右细胞生长 停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40504050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至5050代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，具有癌细胞的特点，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。2、动物细胞培养的条件、动物细胞培养的条件无菌、无毒的环境无菌、

3、无毒的环境 培养液和所有培养用具进行无菌处理培养液和所有培养用具进行无菌处理 措施：培养液中加抗生素，定期更换培养液措施：培养液中加抗生素，定期更换培养液营养营养 糖、氨基酸、无机盐、微量元素、糖、氨基酸、无机盐、微量元素、 促生长因子（维生素、激素等）和动物血清促生长因子（维生素、激素等）和动物血清温度和温度和PH 36.50.5 7.2-7.4气体环境气体环境 O2 CO2 95空气空气 5的的CO23. 动物细胞培养的应用动物细胞培养的应用（）解决为大面积烧伤病人移植皮肤问题。（）解决为大面积烧伤病人移植皮肤问题。（利用贴壁生长和接触抑制原理）（利用贴壁生长和接触抑制原理）（）检测有关物

4、质毒性。（）检测有关物质毒性。（）培养正常或病变细胞，用于科研。（）培养正常或病变细胞，用于科研。（1）获得细胞产物，如蛋白质生物制品）获得细胞产物，如蛋白质生物制品 ： 病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理培养基性质培养基性质培养基特有成分培养基特有成分培养结果培养结果培养目的培养目的二、核移植技术二、核移植技术克隆多利羊培育过程克隆多利羊培育过程黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期胚胎早期胚胎

5、胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利1、过程、过程克隆动物的概念： 用核移植的方法得用核移植的方法得到的动物称为克隆到的动物称为克隆动物动物2、体细胞核移植技术的应用前景、体细胞核移植技术的应用前景 畜牧业、医药卫生以及其他领域畜牧业、医药卫生以及其他领域有着有着 广泛应用前景广泛应用前景1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜 群繁育群繁育2、保护濒危物种，增加动物的存活数量、保护濒危物种，增加动物的存活数量3、可作为生物反应器，生产医用蛋白、可作为生物反应器，生产医用蛋白、克隆动物细胞、组织、器官可作为移植克

6、隆动物细胞、组织、器官可作为移植的供体了解胚胎发育及衰老过程、做疾的供体了解胚胎发育及衰老过程、做疾病模型等病模型等4、器官移植的供体、器官移植的供体3、体细胞核移植技术存在的问题胚胎移植动物幼体产出 概率10克隆动物存在着健康问题克隆动物的食品安全性问题存在争议一、动物细胞融合（细胞杂交）一、动物细胞融合（细胞杂交） 概念：两个或多个动物细胞结合形成概念：两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程一个细胞的过程细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒用灭活的病毒诱导动物细胞融合示意图用灭活的病毒诱导

7、动物细胞融合示意图细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核阅读思考阅读思考 长期以来，为了获得抗体，采用的长期以来，为了获得抗体，采用的方法是把某种抗是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体抗体。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的淋巴细胞可以产生多物发生免疫反应的过程中，体内的淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个淋巴细胞只分泌达百万种

8、以上的特异性抗体，但是每个淋巴细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个淋巴细胞进行无性繁殖，即克隆单一抗体，必须用单个淋巴细胞进行无性繁殖，即克隆怎样才能获得单克隆抗体？怎样才能获得单克隆抗体？仅用细胞培养技术可行吗？仅用细胞培养技术可行吗？ 哪种细胞是可以无限增殖的？哪种细胞是可以无限增殖的？ 有什么方法能使淋巴细胞产生抗体的同时，也有什么方法能使淋巴细胞产生抗体的同时，也能能 无限增殖？无限增殖？ 二、二、 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备抗抗原原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融

9、合、筛选杂交细胞杂交细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群单克隆抗体单克隆抗体1、过程、过程同核体同核体同核体同核体异核体（杂交细胞）异核体（杂交细胞）人工诱导人工诱导还有还有3个个3个以上细胞的融合个以上细胞的融合-第一次筛选得到杂交瘤细胞（3 3）整个制备过程为何要经过两次筛选? ?第二次再筛选出能产生特异性抗体的细胞群 由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是效应B B细胞，而是杂交瘤细胞。 阅读：杂交

10、瘤细胞的筛选 已知细胞合成DNADNA有D D和S S两条途径，其中D D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两条DNADNA合成途径，但一般不分裂增值。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S S途径，但能不断分裂增值。将这两种细胞在试管中混合，加PEGPEG促融。如何将杂交瘤细胞分离出来呢？ 可以在培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。加入氨基嘌呤后，使D D合成途径阻断，仅有D D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的S S途径合成DNADNA而增殖。3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用 与常规抗体相比，单克隆抗体与常规抗体相

11、比，单克隆抗体产量产量高，特异性强，灵敏度高高，特异性强，灵敏度高，优越性十优越性十分明显分明显。（1）作为诊断试剂）作为诊断试剂（2）用于治疗疾病和运载药物）用于治疗疾病和运载药物 作为载体，制成作为载体，制成 “生物导弹生物导弹”，运载抗癌药物。资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，还可以鉴别和定位体内“病灶” 。目前，其主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。 图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产抗破伤图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设

12、计的生产抗破伤风杆菌抗体实验方案风杆菌抗体实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合

13、细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC有关概念解读有关概念解读原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第第1 1代代细胞与细胞与传传1010代代以内以内的细胞称为原代细胞培养。的细胞称为原代细胞培养。传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中

14、继续培养，称为传代培养上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。细胞株：原代细胞一般传至1010代左右细胞生长 停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40504050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至5050代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，具有癌细胞的特点，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。4、器官移植的供体、器官移植的供体一、动物细胞融合（细胞杂交）一、动物细胞融合（细胞杂交） 概念：两个或多个动物细胞结合形成概念：两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程一个细胞的过程细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用 与常规抗体相比，单克隆抗体与常规抗体相比，单克隆抗体产量产量高，特异性强，灵敏度高高，特异性强，灵敏度