间充质干细胞培养方法

1、间充质干细胞培养方法1、间充质干细胞 MS C根本形态2、干细胞应用与干细胞调控.3、间充质干细胞MSC生长过程4、间充质干细胞MSC培养得适宜气体环境5、细胞培养板得选择6、如何选用细胞培养基7?、如何维持培养液 p H8、血清与干细胞得培养9?、胎牛血清F B S 就是否需要灭活1?0、细胞得细菌、真菌污染及排 除？ 11、细胞培养污染得预防1 2、使用胰蛋白酶时参加E DTA得目得就是什么13、胶原酶得种类与选型1? 4、胶原酶V S胰酶1? 5、干细胞得种类与外表标记16、间质干细胞培养原理概述17?、间质干细胞成脂与成骨诱导分化1?8、干细胞老化得表现与处理19?、 细胞传代消化过程

2、指导20?、冷冻保护剂作用与选择21?、细胞冻存指导22、 干细胞冷冻与复苏23、 移植细胞得基因修饰1?.间充质干细胞MS C根本形态？体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征,可分为贴附型生长细胞,常表现为成纤维型细胞与上皮细胞.悬浮 型细胞在培养中悬浮生长.？间充质干细胞MSC根本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物外表 呈梭形或不规那么三角形生长,细胞中央有卵圆形核,胞质向外伸出 2-3厘米个长短不同得突起.可 瞧到细胞成螺旋状生长.?2.干细胞应用与干细胞调控干细胞得调控就是指给出适当得因子条件,对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发展.？2、1内源

3、性调控干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反响从而调节其增殖与分化,包括调节细胞不对称分裂得蛋白,限制基因表达得核因子等.另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控 因子得制约.1胞内蛋白对干细胞分裂得调控？干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞.这种分化得 不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白,特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要.如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体 得细胞器,包含有许多调节蛋白,如膜收缩蛋白与细胞周期素Ao收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位,从而把维持干细胞性状所必需得成分保存

4、在子代干细胞中.？2转录因子得调控在脊椎动物中,转录因子对干细胞分化得调节非常重要.比方在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct4就是必需得.Oct 4就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FG F 4等生长因子,能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分 化.Oct 4缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团.另外白血病抑制 因子LIF对培养彳#小鼠ES细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用,说明不同种 属间得转录调控就是不完全一致得.又如Tcf/Lef转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要 .Tc f /Le

5、 f就是Wnt信号通路得中间介质,当与 0 Cat e n i n形成转录复合物后,促使角质细胞转 化为多能状态并分化为毛囊.?2、2外源性调控除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响.1?分泌因子？间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖,分化与存活.有两类因子在不同组织甚至不同种 属中都发挥重要作用,它们就是TGF0家族与Wn t 信号通路.比方TGF家族中至少有两个成员能 够调节神经崎干细胞得分化.最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子 GDNF不仅能够促进多种神经元得存活与分化,还对精原细胞得再生与分化有决定作用.GDNF缺失得小鼠表现为干细胞数

6、量得减少,而GDNF得过度表达导致未分化得精原细胞得累积. W nts得作用机制就是通过阻止 0-Ca t e n in分解从而激活T c f/Lef介导得转录,促进干细胞得分化.比方在线虫卵裂球得分裂中,邻近细胞诱导得 Wnt信号通路能够限制纺锤体得起始点与内胚层得分化.?(2)膜蛋白介导得细胞间得相互作用有些信号就是通过细胞-细胞得直接接触起作用得.3- Ca t e n in就就是一种介导细胞粘附连接得结 构成分.除此之外,穿膜蛋白N o t ch及其配体D el t a或J a g ged 也对干细胞分化有重要影响. 在果蝇得感觉器官前体细胞,脊椎动物得胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮

7、、骨骼肌与血液系统 中,Not c h信号都起着非常重要得作用. 当Notch与其配体结合时,干细胞进行非分化性增殖；当N otch活性被抑制时,干细胞进入分化程序,发育为功能细胞.(3)整合素(I nte g rin)与细胞外基质？整合素家族就是介导干细胞与细胞外基质粘附得最主要得分 子.整合素与其配体得相互作用为干细胞得非分化增殖提供了适当得微环境.比方当B 1整合素丧失功能时,上皮干细胞逃脱了微环境得制约,分化成角质细胞.此外细胞外基质通过调节整合素得表达与激活,从而影响干细胞得分布与分化方向.？2、3干细胞得可塑性？越来越多得证据说明,当成体干细胞被移植入受体中,它们表现出很强得可塑

8、性.通常情况下,供体得干细胞在受体中分化为与其组织来源一致得细胞.而在某些情况下干细胞得 分化并不遵循这种规律.1 9 99年 Go o d ell等人别离出小鼠得肌肉干细胞,体外培养5天后,与 少量得骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射得小鼠中,结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系.这种现象被称为干细胞得横向分化 (t ran s d i ffere n tia t io n ).关于横向分化得调控机制 目前还不清楚.大多数观点认为干细胞得分化与微环境密切相关.可能得机制就是,干细胞进入新得 微环境后,对分化信号得反响受到周围正在进行分化得细胞得影响,从而对新得微环境中得调节信号做出反响.

9、3.间充质干细胞MSC生长过程？潜伏期-指数增生期-停滞期(1)潜伏期(latent p h as e )细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态得悬浮期.此时,细胞质回缩,胞体呈圆球形,然后细胞贴附于载体外表,称贴壁,悬浮期结束.细胞贴壁速度与细胞 种类,培养基成分,载体得理化性质等密切相关. 一般情况下,原代培养细胞贴壁速度慢, 可达10 2 4小时或更多,而传代细胞系贴壁速度快,通常10-30分钟即可贴壁.细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长与增殖期.原代培养细胞潜伏期长,约 24-96小时或更长,连续细胞系与肿瘤细胞潜伏期短,仅需 624小时.？ ？(2)指数增生期(1 oga

10、 r ithmi c growth p hase ) 这就是细胞增殖最旺盛得阶段,分裂相细胞增多.指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长就 是否旺盛得一个重要标志.通常以细胞分裂相指数(Mitotic index, M I )表示,即细胞群中每1000 个细胞中得分裂相数.一般细胞得分裂指数介于0、1%-0、5% ,原代细胞分裂指数较低,而连续细胞与肿瘤细胞分裂相指数可高达 3 % - 5%.指数增生期得细胞活力最好时期,就是进行各种实验最正确 时期,也就是冻存细胞得最好时机.在接种细胞数量适宜情况下, 指数增生期持续35天后,随着细 胞数量不断增多、生长空间减少,最后细胞相互接触集合成片

11、. 正常细胞相互接触后能抑制细胞运动, 这种现象称接触抑制现象 (con t ac t inhib i tion).而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动与 增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(pi led up) o细胞接触集合成片后,虽然发生接 触抑制,但只要营养充分,细胞仍能进行增殖分裂,因此细胞数仍然在增多.但就是,当细胞密度进 一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养枯竭与代谢产物得影响,导致细胞分裂停止,这种现象称密度抑制现象(D ens i t y Inhi bition).?( 3 )停滞期(Sta g nate phase )细胞数量到达饱与密度

12、后,如不及时进行传代,细胞就会停止增殖,进入停止期.此时细胞数持平,故也称平台期(Plat e au phase ).停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动.如不进行别离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒,出现 形态改变,贴壁细胞会脱落,严重得会发生死亡,因此,应及时传代.?4 .间充质干细胞MS C培养得适宜气体环境干细胞相关得培养液都必须在 5% CO 2得气体环境中培养使用.否那么会对细胞产生影响.气体就 是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气与二氧化碳.氧气参与三竣酸循环,产生供应细胞生长增殖得能量与合成细胞生长所需用得各种成分.开放培养时一

13、般把细胞置于 95 %空气加5 %二氧化碳混合气体环境中.二氧化碳既就是细胞代谢产物也就是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中得主要作用在于维持培养基得 pH值.大多数细胞得适宜pH 为7、2-7、4,偏离这一范围 对细胞培养将产生有害彳#影响.一般情况下,细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生 长.?5.细胞培养板得选择？细胞培养板依底部形状得不同可分为平底与圆底(U 型与V型);培养孔得孔 数有6、12、24、4 8、9 6、3 8 4、1536孔等；根据材质得不同有T era s a k i板与普通细胞培养 板.具体选择时根据培养细胞得类型、所需培养体积及不同得实验目得而定

14、.？(1)平底与圆底(U型与V型)培养板得区别与选择 ？不同形状得培养板有不同用途.培养细胞,通常就是选用平底得,这样便于镜下观测、有明确得底面积、细胞培养液面高度相对一致.因此做MTT等 实验时,无论就是贴壁与悬浮细胞,一般选用平底板.测吸光值一定要使用平底得培养板.要特别注意 材质,标示Ti s sue Culture ( T C) Trea t e d就是养细胞用得.U型或V型板,一般在某些特殊要求日寺才使用.如在免疫学方面,当做两种不同淋巴细胞混合培养畤,需要二者相互接触刺激,这时一 般会选用U 型板,由于细胞会由于重力得作用而聚集在很小得范围内内.圆底培养板还会用于同位素 掺入得实验

15、,需要用细胞收集仪收集细胞得培养,如混合淋巴细胞培养等.V型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验.细胞杀伤这种实验也可用U型板替代(参加细胞后,低速离心).？(2)Tera s aki板与普通细胞培养板得区别T e r a s a ki p la t e主要就是用于晶体学研究,产品设计便于又t晶体得观察与结构分析.有两种 s i tt i ng与handin g drop 两种方法,两种方法应用产品得外形结构也不同.材料上选择crysta l class polymer ,特殊得材料有利观察晶体结构.细胞培养板主要就是P S材料,材料就是treated s uf f ace ,便于细胞贴壁生长与

16、伸展. 当然还有浮游细胞得生长材料,同时还有1 ow binding su r f a ce? (3)细胞培养板与酶标板得区别？酶标板一般要比细胞培养板贵,细胞板主要做细胞培养,也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板与反响板,一般不用做细胞培养,它主要做免疫酶联反响后得蛋白 检测,需要更高得要求与特定得酶标工作液.?(4 )常用不同培养板得孔底面积及推荐加液量？不同孔板所加培养液得液面都不宜太深,一般在23mm 范围,结合不同孔得底面积就可算出各培养孔得适宜加液量(参考下表 ).假设加液量过多会影 响气体(氧气)交换,而且在搬动过程中易溢出造成污染.具体所加细胞密度依实验得目得不同灵活掌 握.

17、常用得培养器皿培养器皿 底面积(cm2)加培养液量(mL)可获细胞量96?孔培养板 0、3 2 0、1 1052 4孔培养板2 1、0 5 X1 0 512孔培养板 4、5 2、0 106?6 孔培养板 9、6 2、5 2、5X1064?孔培养板 28 5、0 7 X 1 0 63、5 cm 培养皿 8 3、0 2、0X1066?cm 培养皿 2 1 5、0 5、2X106 9?cm 培养皿 4 91 0、012、2X10 6 1?0 cm 培养皿 5 5 1 0、0 13、7X1 062 5cm 塑料培养瓶 25 5、0 5、2X10675 cm 塑料培养瓶 7 5 1 530 2 M072

18、5cm 玻璃培养瓶 19 4、0 3 X06100cm 玻璃培养瓶 37、5 10、0 6X10625 0 cm 玻璃培养瓶 78 15、0 2X1072500cm旋转培养瓶70 0 10 0250 2、5 X108?注:各种单层生长得细胞在培养皿中长满得细胞数, 主要取决于器皿底外表积与细胞体积得大小.上表以293 细胞为例给出得可获细胞量仅作参考.?6.如何选用细胞培养基培养基就是维持体外细胞生存与生长得根本溶液,就是组织细胞培养时最重要得条件.细胞培养基大致有：？(1)合成培养基主要成分为：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质(核酸降解物、氧化复原剂等).常用得有：1 9 9细胞

19、培养基及其改进品种.1950年由M o rgan 等设计,除BS S外,含有53种成分,添加适 量得血清后,可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等.1 9 9 (HB)细胞培养基,主要应用于Vero细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、 乙脑等疫苗,具有高缓冲性能,能够有效提升病毒滴度.？ BM E细胞培养基.基石E Eag 1 e 培养基(Ba s al M e dium Eag 1 e), 1 9 5 5 年由E a g le 设计,B S S+12 种氨基酸+谷氨酰胺+8种维生素.简单、便于添加,适于各种传代细胞系与特殊研究用,在此 根底上改进得细胞培养基品种有 MEM、DM EM、I

20、MDM 等.MEM细胞培养基.低限量Eagle 培养基(Mini m al Essential Medium), 1 9 59 年修改配方, 删去赖氨酸、生物素,增加氨基酸浓度 ,适合多种细胞单层生长,就是一种最根本、适用范围最广得培 养基,就是一种被广泛应用得培养基.需要注意得就是,MEM细胞培养基有含 E a r 1 e s平衡盐得类型,也有含 Hanks,平衡盐得类型；有高压灭菌型得,也有过滤除菌型得；还有含非必需氨基酸得 类型.生产与科研时,应根据实际情况注意选择适宜得MEM细胞培养基.另外,因MEM培养基营养成分所限,针对生产之特定细胞培养与表达时,并不一定就是使用效果最正确或者最经

21、济得培养基.DMEM细胞培养基及其改进品种.DMEM由Dul b ecco改进得Eagle培养基,各成份量加倍,分低 糖(1000m g/L)、高糖(4500mg/L ).细胞生长快.附着稍差得肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好, 常用于杂交瘤得骨髓瘤细胞与DNA转染得转化细胞培养.例如C HO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO 细胞表达EPO .IMDM细胞培养基.I MDM就是由I sco ve改进得Eagle培养基,增加了几种氨基酸与胱氨 酸量.可用于杂交瘤细胞培养,以及无血清培养得根底培养基.？RPMI 1 6 4 0 细胞培养基.Moo r e 等人于196 7年在R o sw e ll P

22、ark Memor i al I nsti t ute研制,针对淋巴细胞培养设 计,B S S+2 1种氨基酸+维生素11种等,广泛适于许多种正常细胞与肿瘤细胞,也用做悬浮细胞培养.?Fi s chers细胞培养基.用于白血病微粒细胞培养.HamF10、F12细胞培养基.19 6 3年、1 96 9 年由Ham设计,含微量元素,可在血清含量 低时用,适用于克隆化培养.F10适用于仓鼠、人二倍体细胞,F12适用于CHO细胞.？DMEM /F12细胞培养基.DMEM与F12 细胞培养基根据 1: 1比例混合效果最正确,营养成分丰富, 且可以使用较少血清,或作为无血清培养基得根底培养基.？(2)低血

23、清细胞培养基主要应用于VERO 细胞、B HK21细胞等细胞在转瓶、微载体反响器中得培养.(3)无血清培养基就是设计用来在无血清条件下促使特殊类型得细胞生长或进行专门应用得培养基.需要添加生长因子与或细胞因子,含有个别蛋白或大量蛋白组分.(4)替代天然培养基培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构得组分,所有得成分均有得化学结构.面对如此多得细胞培养基,对细胞培养基得选用,建议 ：可以查阅相关文献,或在购置细胞株时咨询选用最适合细胞株得培养基,或购置相配套得细胞培养 基产品.许多培养基都适合多种细胞株得培养,可以采用现有得培养基进行试验.？根据细胞株得特点、实 验得需要来选择培养基.如小鼠细胞

24、株多项选择1 6 4 0;进行细胞杂交、基因转移实验,可选择IMDM.？结合细胞特性及培养基得培养效能,用多种培养基培养目得细胞,观察其生长状态,可以用生长曲线、 克隆形成率等指标判断,根据实验结果选择最正确培养基.？注：目前也有不少商业化得 msc培养基,如百恩维得间充质干细胞无血清培养基,间充质干细胞培养基(低血清)?7.如何维持培养液 p H配好得培养液变碱(变紫红)就是正常得现象.暴露在空气中得培养液,由于大气中二氧化碳得浓度 很低,培养液中得H CO3 -被渐渐耗掉,培养液得pH值也逐渐升高,变成了紫红色.如果培养基 pH 值偏碱得程度不大,可将装培养液得瓶口拧松,放置于二氧化碳培养

25、箱中一段时间, 让培养箱中得CO2 进入培养液,pH值就可以纠正.如果pH值偏离得程度很大,可以通过添加少量无菌得HCl或者NaOH调节p H,便可以使用.将配制好得培养基小剂量分装,可以预防反复开盖引起其中得二氧化碳 逸出而造成pH升高.同时因NaH CO 3遇热不稳定,会分解释放出C O2,而使培养基得pH升高, 偏碱.因此在配置使用培养得过程中应注意：1(?)动作迅速,不可使培养液长时间处于较高室温下；?(2)配置过程中,混匀时切不可加热.混匀后应立即放入4 C冰箱,待过滤时再取出；(3 )使用完毕应尽快将瓶口封好,放于 4 C冰箱保存.？通过在培养液中同时添加 Hepes 也可以 有效

26、得稳定pH值.Hepes (羟乙基哌嗪乙硫磺酸)就是一种非离子两性缓冲液,它在pH 7、27、4范围内具有较好得缓冲水平.其最大优点就是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定得pH值.在这种培养条件下,细胞培养瓶得盖子应拧紧 ,以预防培养液中所需得少量碳酸盐散入空气中.该缓 冲液使用得终浓度为1 050mmol/L , 一般培养液内含20 mm o 1 / L He p es便可到达缓冲水平. H e pes 得使用方法有以下两种：?( 1 ) He p e s可按所需得浓度直接参加到配制得培养液中,再过 滤除菌.每1 0 0 0 ml培养液中参加2、38 克H E P ES,溶解后用INNaO

27、H调pH 至7、 2,过滤除菌后使用.此时 HEPES得使用7度为10 mmol/L.(2)配成10 Ox贮存液(1 mol/L),使用前取99 mL培养液参加1mL贮存液,最终应用浓度 仍为 10 m m o l/Lo 1 mo 1 /L (100x) Hepes 贮存液配制方法：取 23、8g H epes 溶于 90 ml 双 蒸水中,用IN Na OH 调pH 至7、58、0,然后用水定容至10 0mL,过滤除菌,分装小瓶(2mL /瓶),4 c或-20 C保存.?8.血清与干细胞得培养？干细胞在体内存在得量很少,处在一个个环境相对稳定得 “niched,所以一 旦完成别离进入体外环境

28、,最重要得就就是保证细胞得活力不受影响,那么就必须提供一个相对稳定得培养环境.这些环境就就是靠培养基与培养箱来提供了.培养液中最重要得莫过一一-一血清,特别就是对干细胞来说.所以为了最优得干细胞培养效果,推荐选用对应得干细胞专用血清.牛血清就是最常用得,但就是根据血清得来源不同又可以分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清.胎牛血清应取 自剖腹产得胎牛；新牛血清取自出生 24小时之内得新生牛；小牛血清取自出生1 0 30天得小牛. 显然,胎牛血清就是品质最高得,由于胎牛还未接触外界,血清中所含得抗体、补体等对细胞有害得成 分最少,所以也成为了干细胞培养得首选.培养中如何正确得使用血清？预防不好得影响呢

29、？血清得浓度：对大局部得干细胞,最正确得血清浓度就是10%.过高得血清浓度会导致细胞出现分化得现象,如果就是需要高浓度得血清,培养得时间也不能超过两周,否那么会导致细胞分化水平下降.过 低得血清会导致细胞得增殖速度下降.血清得溶解：必须在4 c进行,最好过夜溶解.这样可以减少沉淀 得产生,预防营养物质得流式.同时也要预防血清得过滤,如果需要过滤可以与培养基一起过滤.细胞 培养液中添加得血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清就是最常用得血清,分为胎牛血清与新生小牛血清.胎牛血清就是从母牛破腹取出得胎牛中别离出得血清,价格昂贵.新生小牛血清就是 从刚出生得尚未哺乳得小牛中别离出来得血清,如厂家

30、能做到这一点,新生小牛血清得质量与胎牛血清 得质量相差不大.如小牛出生后已哺乳,从这种小牛中取出得血清中可能含有较多得生物活性物质,其质量明显不如前两种.血清得质量,种类及使用得浓度都有可能影响细胞得生长,而不同批次得血清支持细胞生长得水平也 不同,尤其就是对克隆细胞得生长,某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长得物质.注意以下几点：?1 需要长期保存得血清必须储存于-20 c或-80 c低温冰箱中.4 C冰箱中保存时间切勿超过1个 月.由于血清结冰时体积会增加约 10%,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间, 否那么易发生污染或玻璃瓶冻裂.2 瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20

31、 C或80 C低温冰箱中彳#血清放入4 c冰箱中溶解 1 天.然后移入室温,待全部溶解后再分装 .在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀小心勿造成气泡, 使温度与成分均一,减少沉淀得发生.切勿直接将血清从 -20 C进入37 c解冻,这样因温度改变太 大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀.影响使用效果 ！3热灭活就是指5 6 C, 30分钟加热已完全解冻得血清.加热过程中须烧即摇晃均匀.此热处 理得目得就是使血清中得补体成分plement 灭活.除非必须,一般不建议作此热处理,由于热处 理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清得质量.补体参与反响有 ：细胞毒作用,平滑肌细胞 收缩,肥大细胞与血小板释放

32、组胺,增强吞噬作用,促进淋巴细胞与巨噬细胞发生化学趋化与活化. 4 切勿将血清在37 c放置太久,否那么血清会变得浑浊,同时血清中得有效成分会破坏而影响血清 质量.5?血清中得沉淀物 絮状物：主要就是血清中得脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身得质量.可用离心3000 rpm,5分钟去除,也可不用处理.显微镜下小黑点：经过热处理过得血清,沉淀物得形成会显著增多.有些沉淀物在显微镜下观察象小黑点常误认为血清受污染.一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长.？9 .胎牛血清F B S 就是否需要灭活？灭活得目得就是去除血清中得补体成分,预防补体对细胞 产生细胞毒害作用.胎牛

33、血清FBS对许多细胞系均有促生长作用,主要适用于细胞株得保藏及 特殊用途得细胞株得体外培养.胎牛血清就是取自剖腹产得胎牛.由于胎牛还未接触外界,血清中所 含得抗体、补体等对细胞生长有害得成分最少,质量就是最高得.所以不必要灭活.10 .细胞得细菌、真菌污染及排除真菌污染就是细胞培养过程中最常见得一种,尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染.污染培养细胞 得多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孑S子霉、白念珠菌、酵母菌等.霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物.一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不混浊,倒置显微镜下可见于细胞 之间纵横交错穿行得丝状、管状、及树枝状菌丝,并悬浮飘荡在培养液中.很

34、多菌丝在高倍镜可见到有链状排列得菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形,散在细胞周边与细胞之间生长.镜下瞧时,要将培养瓶 用酒精棉球擦干净,以预防与瓶外尤其瓶底外面生长得菌丝相混淆.真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性彳用而使细胞脱落死亡.?细菌就是一种原核细胞微生物,其大小以微米am计.常见得污染细菌有革兰氏阴性菌与大肠杆菌、假单胞菌等,革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比拟 常见.一旦发生细菌污染较易发现,多数情况下培养液短期内颜色变黄,说明有大量酸性物质产生,出现明显混浊现象；有时静置得培养液液体初瞧不混浊,但稍加振荡,就有很多混浊物漂起.倒置显微镜下观察,可见培养液中有大量圆球状颗粒漂

35、浮.必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种 类；有得培养液改变不明显而又疑有污染,可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物得培养液接种,也可取10m 1细胞悬液以100 rpm 离心5m i n,沉淀中参加无抗生素得培养液 2ml,置于3 7c培养,24 h可得结果.污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败与细胞株系丧失.?细菌与真菌污染多在传代、 换液、加样等开放性操作之后发生, 而且由于增生迅速,多再发生污染4 8h以内就已明显.在实验得最初两天密切观察实验样品就是否有 污染发生,有利于及时采取举措予以补救或排除.培养细胞一经污染,多数较难处理

36、.如果污染细胞价值不大,宜弃之；有细胞株留存得或可购置得,可在寻找原因后彻底消毒操作室与二氧化碳培养箱假设发现真菌污染,可在污染孔内参加 1mo 1/L氢氧化钠或硫酸铜？1 1.细胞培养污染得预防？溶液处理(具体操作方法可参考细胞培养污染得预防),复苏或重新购置细胞 再培养.假设污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采用510倍于常用量得抗生素冲击,参加高浓度 抗生素后作用2448 h ,再换入常规培养液,有时可能奏效.细胞培养中常用得抗生素及用量见下表. ?常用抗生素用量与效应抗生素抗菌谱 浓度(量/mL)? 细菌真菌支原体青霉素 G+ 1 0 0 - 1 0 0 0 iig ?链霉素 G 1

37、00-1 0 0 0ag庆大霉素G+ /G - + 5 02 0 0ag四环素G+ /G+ 1050 ag卡那霉素 G+ /G + 1001000ag两性霉素+ 常用2心g/m L?制霉菌素+常用2 5心g/mL+表示效应程度 ？高浓度得抗生素与抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而 ,做剂量反响实验确定 抗生素与抗霉菌素产生毒性得剂量水平.这点在使用抗生素如两性霉素B与抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要.下面就是推荐得确定毒性水平与消除培养污染得实验步骤 (1)在无抗生素得培养基中消化、计数与稀释细胞,稀释到常规细胞传代得浓度(2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中.在一个浓度梯度范围内

38、,把选择抗生素参加到 每一个孔中.例如,两性霉素 B推荐以下浓度,0、2 5 , 0、5 0, 1、0 ,2、0,4、0, 8、0 m g/ml o ?(3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,集合度下降与变圆.？(4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度 23 倍浓度得抗生素得培养液培养细胞2 3 代.？(5)在无抗生素得 培养基中培养细胞一代.?(6)重复步骤4 o 7(?)在无抗生素得培养基中培养 46代,确定污染就是否以已被消除.?1 2 o使用胰蛋白酶时参加E DTA得目得就是什么？体外培养得细胞受到严重污染时,有时即使想尽各种方法也难以挽回.因此,预防污染 ,预防就是关键.只

39、有将预防举措贯穿于整个细胞培养得始 终,才能将发生污染得可能性降到最小程度.一般预防可从以下几方面着手：(1)添加抗生素 各种抗生素性质不同,对各种微生物得作用也不同 ,联合应用比单用效果好,预防性 应用比污染后使用好(但迄今尚无对抗支原体特效抗生素).但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性, 且对细胞本身也有一定影响,因此为预防诱导抗药细菌,应定期更换培养系统中得抗生素,或尽可能不用抗生素处理.?( 2 ) 从物品、用品消毒灭菌着手 细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在取样检菌一周后确认无菌才能使用.同时,在无菌过滤操作中,随着滤过体积得增大,滤膜破损得可能性 增加,

40、故应选择最后过滤得液体进行检测.定期对二氧化碳培养箱进行消毒.具体操作：75%得酒精搽拭培养箱后,使用可移动得紫外灯至少消毒 30min,参加高压灭菌过得超纯水于培养箱水槽中保持湿 度.也可配制300m 1 得饱与硫酸铜加3L灭菌超纯水混合成硫酸铜溶液参加水槽中 .？(3)从操作 者做起进无菌室前要彻底洗手,按规定穿隔离衣.开始操作前要用7 5 %酒精棉球擦手、擦瓶口与烧灼瓶口.操作者动作要轻,安装吸管帽、翻开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行.但要注意 金属器械不能在火焰中长时间烧灼,以防退火；烧过得器械要冷却后才能使用；已吸过培养液得吸管 不能再用火焰烧灼,因残留在吸管内得培养液成

41、分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质,吸管再用时会将其带到培养液中；胶塞、橡皮乳头及塑料得细胞培养用品过火焰就是也不能时间太长,以免烧焦产 生有毒气体,危害培养细胞,同时塑料细胞培养用品也会产生变形影响使用.使用培养液前不宜过早开瓶,开瓶后得培养液应保持斜位,预防直立,以预防下落细菌得污染.不 再使用得培养液应立即封闭瓶口 ,培养得细胞在处理之前勿过早暴露在空气中.？操作时尽量不要谈话,咳嗽以预防来自唾沫与呼出得气流所造成得污染.吸取培养液、细胞悬液时,应专管专用,一旦发现吸管口接触了手与其她污染物品应弃去,以预防污 染扩大或造成培养物之间得交叉污染.操作完毕后应整理好工作台面,用消毒水浸泡得纱布

42、擦拭台面.？4预防细胞交叉污染所有从别处转来得或就是自己所建得细胞系都要早期留有得充足得冻存储藏,一旦疑心发生交叉污染,可做细胞遗传学方面得鉴定,如发现原有得细胞遗传物发生改变,可以复苏早期冻存得细胞使用.重要细胞系株得传代工作应由两人独立进行.5无菌室得彻底消毒？新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室.使用前应稀释即配即用.新洁尔灭与酒精 相比,最大得优点就是廉价,由于新洁尔灭500ml只需5元,而且可以稀释50倍用,而同样量得酒精价格可能就是新洁尔灭得几十倍.？甲醛熏蒸法：甲醛就是一种广谱灭菌剂菌,其水溶液与气体对 各种细菌、芽胞及真菌等微生物均有杀灭作用.甲醛价廉,熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、

43、橡 胶等.市售得甲醛水溶液中一般含3 7 4 0%得甲醛.？13 .胶原酶得种类与选型？在细胞得取材中,各种消化酶经常用于组织得分散,在组织中取得目得细 胞.例如脂肪间质干细胞ADSCs卜软骨细胞培养等.其中胶原酶就是最常用得一种.？种类:I-IV型选择:结缔组织I, I I I型；骨组织、脂肪组织I型；软骨组织I I 型;胰岛细胞IV 型.崩裂 酶Di s pase作用：用于增强胶原酶得消化水平,对细胞损彳最小.1？4 .胶原酶 VS胰酶 胰蛋白酶T r yp s in ,简称胰酶,可使细胞间得蛋白质水解从而到达细胞离散得目得,就是目前 应用最为广泛得消化剂,主要采自牛或猪得胰脏,呈白色粉末

44、状,易潮解,应在低温枯燥处保存.胰酶适 用于细胞间质较少得软组织如胚胎、上皮、羊膜、肝、肾等软组织及传代细胞得消化,但对于纤维性组织或较硬得癌组织那么效果较差.胰酶活性可用消化酪蛋白得水平表示,常见有1: 125 与1 :25 0,即一份胰酶可消化12 5或2 5 0份酪蛋白.组织培养用胰酶溶液一般配制成 0、10、25 %浓度, 常用0、25%,特别敏感得可以使用0、 12 5 %.胰酶得消化效果主要于pH值、温度、胰酶得浓度、 组织块得大小与硬度有关.胰酶作用及溶解得最正确 pH就是89,配制胰酶溶液可将液体调至 pH8左 右,充分溶解,过滤除菌,过滤后再调至p H7、4左右.胰酶作用得最

45、适温度为37 c在夏季室温25 c 以上对一般传代细胞也能到达消化效果.一般新鲜配制得胰酶消化水平较强.消化时间要根据不同得情况而定,胰酶对细胞得别离效果与细胞得类型、特性与瓶壁外表特性有关.一般来说,温度低,组织块大、胰酶浓度低者,消化时间长,反之那么相应减少时间.酶得浓度过大或消化时间太长,会导致消化过度,对细胞得活性损伤较大,并有局部细胞漂浮,被消化掉；消化时间太短,消化缺乏那么细胞难于从 瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性,也达不到分散细胞得目得.影响消化速度得因素较多,主要有胰酶溶液得活性配制条件、冻存或 4c保存时间长短、就是否反复冻融、化冻后存放时间及 温度等、消化时得温度

46、气温、细胞培养瓶及胰酶溶液得温度以及所加胰酶溶液得多少等.在使用胰酶进行消化时,可改变不同参数以确定出最正确消化效果.？胰酶得配置方法：？ 1 称取胰酶：按胰酶液浓度为0、25 %,用电子天平准确称取粉剂溶入 PBS或D-hanks中,低速搅拌34小时或者 置于4 c过夜混匀低速很重要,机械搅拌对酶就是一种冲击,如果起沫严重,有可能导致酶得变性. ?0调节pH 值为7、4左右.用注射滤器过滤除菌,因蛋白制剂不宜4 c长期保存,忌反复冻融,建议分装成小瓶离心管于 一20 C冻存或置4 c保存备用.考前须知：？就是否需要4 c放置过夜,取决于胰酶得纯度.过去得胰酶纯度不高,所以难以溶解, 需要4c

47、过夜.而现在得胰酶纯度都很高,就没有必要4c过夜.从理论上来说,4 C放置过夜,给细菌生 长得时机,尽管过滤可以除去细菌,但除不掉其代谢产物.？如果胰酶不溶、有絮状物,考虑可能得原因有：胰酶过期或就是已经局部变性；溶液 pH值不对;在没过滤之前得絮状沉淀就是正常现 象,因胰酶多取自动物胰腺,沉淀为组织块,过滤后即可.？Ca2+、Mg2+、血清与蛋白质对胰酶得活 性有一定得抑制作用,所以需用不含C a2+、Mg2+、这些离子得BS S如D-Han k s 或者P B S来 配制.正就是这个道理,开始消化前,需用PBS将培养液冲洗干净前方参加胰酶进行消化,否那么会大 大影响胰酶得作用效果.终止消化

48、时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞得作用.对于一些贴壁特别牢固得细胞,可在上述配方中,参加0、02%得EDTA,将胰酶与EDTA 乙二胺 四乙酸混合来进行消化.EDTA可通过结合螯合细胞间质中得二价阳离子从而破坏细胞连接从而增加消化效力.但因ED TA不能被血清中与,终止消化后,需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶板, 使得更好得再次利用培养瓶板,否那么再培养时可能会导致细胞容易脱壁.EDTA在常温下难溶于酸, 微溶于水2 0 C时溶解度只有 0、02 g ,但在碱性溶液中溶解性较大.因此为了更快得溶解 EDTA 可采取调节 P H或者就是加热得方法.但须注意：由于胰酶不耐高温,因

49、此待EDT A溶解后,温度有所下降才能参加胰酶.如果就是单独配置 EDTA溶液,配制后可过滤除菌,也可高温消毒灭菌. 胶原酶c o lla g enase 就是从溶组织梭状细胞芽胞杆菌提取制备得,主要水解结缔组织中胶原 蛋白成分.当拟消化得组织较硬,内含较多结缔组织或胶原成分时,用胰蛋白酶解离细胞得效果较差, 这时可采用胶原酶解离细胞法.胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大.因此适于消化别离纤维性组织、上皮及癌组织,可使上皮细胞与胶原成分别离而不受损害.常用剂量为最终浓度2 O0U/ml 约为1mg/mL 或0、03%0、3%.胶原酶分为I、n、m、IV、V型以及肝细 胞专用胶原酶

50、,要根据所要别离消化得组织类型选择胶原酶类型.具体可见胶原酶得种类与选型.胶原酶消化缓与、无须机械振荡,因而可进一步提升细胞成活率,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实 验本钱.胶原酶得配置胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌与储藏.关于胰蛋白酶配置方法可 见:胰蛋白酶消化法.注意：由于I型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌.钙、镁离子 与血清成分不会影响胶原酶得消化作用,因而可用BSS 如D- h a n k s或者P B S或含血清得培养液配制.胶原酶得使用：？ 1将漂洗、修剪干净得组织剪成 12mm 3左右小块2将组织块放入离心管三角烧瓶中参加3 050 倍体

51、积得胶原酶溶液,旋紧盖子密封烧瓶. 3将烧瓶放入37 c水浴或者37c孵箱内,每隔3min振摇一次,如能放在37 c得恒温震荡水浴箱 中那么更好.消化时间与组织得类别很有关系, 对于某些肿瘤组织或其她较致密结缔组织,消化时间44 8h,对于容易消化得组织可以采用3 7 C震荡消化1545m i n,也可以根据具体情况而定.如组 织块已分散而失去块得形状,一经摇动即成细胞团或单个细胞,可以认为已消化充分.上皮组织经胶原酶消化后,由于上皮细胞对此酶有耐受性,可能仍有一些细胞团未完全分散,但成团得上皮细胞比 分散得单个上皮细胞更易生长,因此,如无特殊需要可以不必再进一步处理.4收集消化液有时含个别组

52、织块及没有充分消化得组织碎屑那么需用100目不锈钢网过滤,离心1000 r/min,5m i n,去除上清,用Hanks液或者无血清培养液离心漂洗 12次,去除上清, 加培养液制成细胞悬液,接种培养瓶.？胶原酶V s胰蛋白酶 胰蛋白酶与胶原酶消化时间与浓度上得差异,依消化温度而异.另外这两种酶也可混合应用,浓度为:胰蛋白酶0、1 mg+胶原酶0、25mg/mL.两酶相比得差异见表1与表2.表1胰蛋白酶与胶原酶生物活性得差异？工程 胰蛋白酶 胶原酶消化特性 适用于消化软组织 适用于消化纤维多得组织？用量0、0 1%0、5% 0、10、3 m g/mL 2 0 0 U/mL消化时间 0、5 2 h

53、 112h?pH 89 6、57、0作用强度 强烈 缓与？细胞影响 时间过长有影响 无大影响 血清抑活有无Ca2+与M g 2 +有影响无影响？表2胰蛋白酶与胶原酶在不同温度下消化各种组织小块0、51cm3 时所需时间h酶种类与用量 较硬组织 软组织4?C室温37c 4 c室温3 7C?胰蛋白酶0、25% 244 8 1612 12 24 120、51胶原酶 1 2 0 0 U/mL 24 6 0、5 12 30、2 5胰蛋白酶0、25% + 胶原酶2 0 0 U/mL 12-46 1 22 4 4 -12 1 2 24 61 2 1 2?15o干细胞得种类与外表标记通过流式细胞仪分析,间充质

54、干细胞特异性外表抗原有：SH2、SH3、CD29、C D44、CD 7 1、CD90、CD10 6、CD 120 a、CD124.BMSC:就是骨髓中除HSC以外得非造血性干细胞,骨髓中绝 大多数就是HSC,BM SC只占骨髓有核细胞得 0、00 1%0、01%.因此鉴定BMSC 得方法 就是在骨髓得干细胞中排除 H S C BM S C:CD45 一、CD 34 CD29+、CD 1 4+/ H S C: C D34+ o? 1 6.间质干细胞培养原理概述？间质干细胞(m e sen c h y mal stem cel 1 ,M S C)就是一群中胚层来 源得具有自我更新与多向分化潜能得多

55、能干细胞,在适宜得培养条件下可分化成多种组织细胞 ,包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等.?间质干细胞最早就是从骨髓中别离得到得,正常情况下, 它在骨髓中得比例非常低,仅占单核细胞得1/105 1 /104 .骨髓中单个核细胞包括淋巴细胞与单核细胞,其体积、形态与密度与其她细胞不同,红细胞与多核白细胞密度较大,为1、0 90 g/ml左右,而淋巴细胞与单核细胞密度为 1、075 1、090 g/ml,血小板为1、030 1、035 g/ml.为此利 用一种密度介于1、075 1、092 g/m 1之间而近于等渗得溶液(分层液)进行密度梯度离心,使一 定密度得细胞按相应密度梯度分布,从而

56、将各种血细胞加以别离.常用得分层液有Fi c o 1 l与Percoll 两种.在骨髓得原彳培养物中,除了贴壁生长得成纤维细胞样得间质干细胞外,还混杂着一些巨噬细胞、单 核细胞、造血细胞及红细胞等,要得到较均一得间质干细胞,必须除去其她细胞.根据其她细胞得特性,可采用不同得方式排除它们.对于红细胞,因其不贴壁,可通过换液除去.对于贴壁得单核巨噬细胞, 可根据其黏附水平得不同,通过调整 T r ypsin/ED TA得消化时间,保证间质干细胞在短暂得作用 时间内与塑料培养瓶壁别离,而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养瓶壁,从而使间质干 细胞与其她得贴壁细胞得到别离.在传代培养中,接种密度

57、就是影响体外培养间质干细胞增殖潜能得重要因素.低密度接种时,间质干细胞得增殖水平明显提升,而诱导细胞分化时那么需要较高得细胞密度,这可能与分化时细胞与细胞间得相互作用有关.而在培养过程中,假设细胞过度融合会促进其分化趋向,故要保持干细胞未分化状态, 要及时传代.?17.间质干细胞成脂与成骨诱导分化？成骨与成脂诱导就是鉴定干细胞得一种重要得方法,也就是最 常用、报道见得最多得方法.成骨最常用得染色方法就是茜素红染色(碱性磷酸酶),成脂诱导最常用就是Oil Red O (油红O)染色法.下面我介绍一下这两种染色方法得原理与步骤.茜素红染色方法与原理：成骨诱导得过程就是使钙离子能够以钙盐得方式沉淀下来,这就就是我们常说得 钙结节.鉴定钙结节得染色方法常用茜素红 步骤：(1)吸去诱导液,再P BS洗一到两次;? ( 2 )参加1 0%中性甲醛,固定30m i n 60min; (3)吸去固定液,参加0、1%得