人脂肪干细胞体外培育及向软骨细胞诱导分化的实验研究

1、人脂肪干细胞体外培育及向软骨细胞诱导分化的实验研究王中兴，鹿均先，熊传芝【摘要】目的：观看人脂肪基质干细胞（ADSCs）体外分离培育 及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状，探讨其作为软骨组织工程种 子细胞的可行性。方式：（1）人脂肪组织来源于健康成年女性腹部吸 脂术，酶消化法分离出ADSCs,体外培育扩增。（2）取第3代ADSCs, 测细胞生长曲线,流式细胞仪测原代细胞表而标记;成脂和成软骨诱导 分化。（3）倒置显微镜观看油红0、阿尔辛蓝（AB PSA）染色和II 型胶原免疫细胞化学染色检测分化情形；RT PCR检测相关标志基因 表达。结果：（1）体外培育的ADSCs细胞形态均一，传代稳固。（2

2、）经 成脂诱导,细胞内显现空泡,油红0染色呈红色,RT PCR检测到有 Leptin、PPAR 丫表达；经成软骨诱导,AB PSA染色呈紫红色，型 胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色,RT PCR检测COLL II, S0X9和 aggrecan表达。结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化,可作为 软骨组织工程种子细胞。【关键词】脂肪基质干细胞；分化；软骨；组织工程最近几年来组织工程学进展迅速，为骨科医治恶疾带来了新的希 望，可是如何取得大量的种子细胞却一直制约其进展，通常骨组织工 程所用的骨髓基质干细胞(BMCs)由于难以分离和培育，限制了其成 为良好的组织工程种子细胞来源。本实验通过对成人

3、皮下脂肪组织来 源干细胞的分离、培育、鉴定及向软骨定向诱导，以期成立获取脂肪 来源干细胞和诱导其向软骨细胞分化的方式，为组织工程软骨的构建 提供新的种子细胞。1材料和方式材料本实验所用脂肪组织来自于东南大学医学院附属徐州医院整形 外科腹部吸脂者，均为女性，年龄2045岁。I型胶原酶为美国 Worthington公司产品，DMEM粉剂为GIBC0公司产品，胎牛血清(FBS) 为HYCL0NE公司产品，兔抗人II型胶原多克隆抗体及免疫组化试剂盒 购自北京中杉金桥生物技术,逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。方式脂肪基质干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)的

4、分 离培育无菌条件下取脂肪组织，% I型胶原蛋白酶消化(放入37 震颤水浴槽中60 min）, 1 200Xg离心10 min,去除漂浮的脂肪细胞 及上清液,DMEM培育液（含10%胎牛血清、100 Ug 清液青霉素和 100 Ugml-1链霉素）重悬细胞，接种至培育皿中，以3X10 4个 有核细胞-cm-2密度接种，在37 、5%C0二、饱和湿度为100%的 培育箱中孵育，48 h后第一次换液，弃去未贴壁细胞。细胞生长至 75%90%融合时传代，每23 d改换培育液。MTT法测生长曲线 取第3代细胞消化制备成单细胞悬液，调整 细胞悬液浓度为IX 107L-1,接种于24孔板,每孔接种1 ml

5、,分8组, 每组3孔，共24孔。天天计数1组，取3个孔的均值。绘制细胞生长 曲线，计算细胞群体倍增时刻。向脂肪细胞诱导（1）取第3代细胞，以X 107L-1密度接种于 预先放置了小玻片的24孔板，置于37 、5%C0二、饱和湿度培育箱 内培育。待细胞爬满玻片后用成脂诱导培育基（高糖DMEM、10%胎牛血 清、mmol L-l IBMX、1 U mol L-1 地塞米松，10 口 molL-l 胰岛 素、1%青链霉素原液）诱导分化2周，每72 h换液1次，相差显微镜 观看。（2）成脂特性检测：取成脂诱导2周后的玻片，10%甲醛溶液固 定10 min后水洗，于60%异丙醇溶液内侵洗。油红。染液染色

6、1015 min,双蒸水内洗，甘油明胶封固，显微镜下观看，RT PCR检测相关标志基因表达情形。向成软骨诱导（1）取接种于25 cm2培育瓶培育至第3代的细 胞,用成软骨诱导培育基（高糖DMEM、1%胎牛血清、10 Ug-L-1 TGF B 一、50 nmol LT抗坏血酸、mgLT胰岛素、1%青链霉素原液） 诱导分化2周，相差显微镜观看。（2）成软骨特性检测。阿尔辛蓝（ABPSA）染色：4%多聚甲醛固定细胞，Alcian Blue染液（Alcian Blue g、蒸储水97 ml、冰醋酸3 ml）孵育30 min,蒸储水洗，1%过碘酸水 溶液氧化510 min, Schiff试剂染20 mi

7、n,苏木精染核,甘油明胶封 固。II型胶原免疫组织化学染色：4%多聚甲醛固定细胞，蒸馀水洗, 加U - ml-1软骨素酶ABC, 37 孵育30 min,加3%H202甲醇去除内 源性过氧化氢酶的作用，蒸播水洗，力口 5%BSA室温作用20 min,加1 ： 100稀释的兔抗人H型胶原多克隆抗体,4 孵育留宿。按试剂盒说明 依次加入二抗、SABC和DAB显色，苏木精对照染色。RT PCR检测相 关标志基因表达情形。2结果原代ADSCs形态学观看细胞接种后24 h开始贴壁，初为小圆形，直径5 nm,色深。48 h后大部份细胞已贴壁生长，呈梭形或多角形，细胞直径增加到20Um左右，呈集落样生长（图

8、1）。细胞增殖活性测定接种后的2 d内细胞种群处于停滞期，36 d为对数生长期，第 8天进入平台期（图2）。细胞群体倍增时刻为55 ho原代细胞表面标记的鉴定流式细胞仪检测显示，与干细胞相关的抗原CD10五、CD10六、 CD16六、CD29等表达率均大于60%； CD 49d表达率高达%，与造血系统 相关的抗原CD 34表达率为%,与内皮细胞相关的抗原CD31表达率为。 向脂肪细胞诱导结果细胞于诱导开始后即停止割裂增殖，慢慢由长梭形变成不规那么 的圆形，体积增大,但大小不一。最先于诱导后4 d即可在细胞内看到 小的脂滴，脂滴慢慢增多，有的彼此融合形成较大的脂滴。诱导14 d 时细胞分化达到顶

9、峰，经油红0染色证明为脂滴（图3）o RT PCR 检测到有Leptin、PPAR 丫表达（图4）。向软骨细胞诱导结果单个细胞形态无明显转变，随诱导时刻延长,在细胞密度较大处细胞群慢慢聚集。诱导7 d后即可在聚集细胞的表面看到微黄色的物质积存,量慢慢增多，14 d时达到顶峰。免疫组化显示ADSCs成软骨诱导后表达II型胶原（图5）, RT PCR检测到COLL II、SOX九、aggrecan表达（图6）； ABPSA染色的细胞分泌有中性或酸性黏多糖成份（图7）o3讨论关节软骨损伤的修复仍是骨科临床面临的挑战之一。传统的医治 方式如骨软骨移植及关节置换术并非能完全恢复透明软骨的结构，组 织工程

10、学的兴起为关节软骨损伤医治提供了新的选择lo组织工程 软骨的构建中，关键的任务是寻觅适合的种子细胞，自体和异体软骨 细胞来源相对较少，骨髓来源的间充质干细胞取材相对困难而且只能 获取到相对少量的干细胞。Zuk等2于2001年在人体皮下脂肪组 织中提取到了具有多向分化能力的细胞，并称之为脂肪来源的成体干 细胞（PLA或ADSCs）。脂肪组织临床较易大量获取而且对患者造成的痛 楚较小，可取得的干细胞数量较多，体外扩增时刻短，缩短了取材和 将组织工程软骨植入患者体内的时刻。因此，脂肪来源的干细胞作为 组织工程软骨构建中种子细胞的新选择而日趋受到重视。本实验从人脂肪组织中成功分离出ADSCs,细胞增殖

11、速度稳固， 群体倍增时刻约为55 h。细胞可传至10代以上，形态无明显改变。另 外,在细胞分离、纯化进程中，一些混杂细胞（如红细胞、内皮细胞等） 很难完全清除，但其数量很少（占细胞群的5%20% 3），而且，这些 细胞会在随后的培育中慢慢减少。木实验通过流式细胞仪对细胞进行 检测证明，到第3代时，细胞纯度可达到95%以上。Mitchell等4通过实验发觉，随着体外培育时刻的延长，脂 肪干细胞的间质细胞相关表型慢慢增加。本实验流式细胞仪检测显示, 与干细胞相关的抗原CD10五、CD10六、CD166和CD29等表达率均大 于60%;CD49d表达率高达猊与造血系统相关的抗原CD34表达率为版 与

12、内皮细胞相关的抗原CD31表达率为%，说明取得的原代细胞是由未 分化的基质干细胞、内皮细胞、造血系细胞等组成的混合细胞群。由 于目前尚未特异性的间充质干细胞表面标志,因此,流式细胞仪和免疫 组化染色检测结果对干细胞的确认只能起到辅助作用。为进一步确认 本实验所得细胞具有干细胞特性，对细胞进行了多系定向诱导,经特殊 染色,RT PCR检测到Leptin、PPAR y等脂肪细胞特异表达基因及 软骨细胞特异表达基因Aggrecan. S0X9和H/X型胶原，证明可向成 脂、成软骨方向分化。本实验结果说明，人脂肪来源的间充质干细胞在必然的条件下能 够定向诱导分化为软骨细胞。另外，吸脂术简单易行，取材量

13、大，可反 复操作，有利于干细胞自体移植的开展。因此，人ADSCs为咱们展现 出普遍的应用前景，有望成为良好的组织工程种子细胞来源。【参考文献】1 VACANT I C A, VACANT I J and cartilage reconstruction with tissue engineering approaches j . Otolaryngol Clin North Am, 1994, 27:263276.2 ZUK P A, ZHU M, MIZUNO H, et cells from human adipose tissue:implications for cell based therapies J . Tissue Eng, 2001, 7(2) :2U228.3 ROBERT L.干细胞手册M.北京: