免疫组化原理、步骤及要注意的事项

1、-可编辑修改-免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原 位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量 测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来， 借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞 水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体 的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的 关系，确认受染细胞类型，从而

2、有助于了解疾病的发病机理和病理过程。免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上， 制成酶标抗体，再借酶对底物 的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显 微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可 将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记 的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体， 最好是特异性 强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶-可编辑修改-标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。三，免疫组化步骤1, 切片，烤片

3、 60C,1h;2, 脱蜡及复水二甲苯 10min, 100%乙醇 5min, 95%乙醇 5min, 90%乙醇 5min, 85%乙醇 5min,80%乙醇 5min, 75%乙醇 5min, 60%乙醇 5min, 50%乙醇 5min, 30%乙醇 5min,自来水 1min,双氧水 1mi n；3, 1 份 30% H2O2 加 10 份蒸馏水，室温 10min,蒸馏水洗 3 次，每次 3min；4, 微波修复将切片浸入 0.01M 枸橼酸缓冲液，微波中最大火力(98E-100C)加热至沸腾，冷却(约 5-10min),反复两次；5, 将切片自然冷却至室温，PBS 洗涤 3 次，每次

4、 5min；6,封闭，5%BSA,室温 20min,甩去多余液体;-可编辑修改-7,滴加一抗，37C,1h,或者 4C过夜;8,PBS 洗涤 3 次，每次 3min；9,滴加二抗，37C,15-30min；10, PBS 洗涤 3 次，每次 3min；11, 滴加 SABC, 37C, 30min；12, PBS 洗涤 3 次，每次 5min；13, 1ml 蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀;14, DAB 显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约15, 自来水冲洗干净，过蒸馏水;16, 苏木素复染 2min,自来水冲洗;17, 脱水30%乙醇 3min, 50%乙醇 3min, 7

5、0%乙醇 3min, 80%乙醇 3min, 90%乙醇 3min,95%乙醇 3min, 100%乙醇 3min,二甲苯 20min；5min） ；-可编辑修改-18, 树胶封片，镜检。四，免疫组化常见问题分析1, 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；3） 有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS 不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。2, 边缘效应1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面

6、试剂洗尽所致解决办法：制备优质的胶片（APES 或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于 4 微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织；2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm 。 用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘 3-4mm。3,产生组织切片非特异性染色1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/ 二-可编辑修改-抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；2） 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；3） 内源性

7、过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4） 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5） DAB 孵育时间过长或浓度过高；6） PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤为重要；7） 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。4,免疫组化染色呈阴性结果-可编辑修改-1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误;2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高

8、火 4 次*6min 试试。有人做过实验，这是 最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复；3） 组织切片本身这种抗原含量低；4） 血清封闭时间过长；5） DAB 孵育时间过短；6） 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；7） 开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方 法问题。1,考虑一抗浓度高;2,然后调整 DAB 孵育时间;3, 也要考虑血清封闭时间是否过短；4, 适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。5,背景-可编辑修改-免疫组化的经验总结（1）-常见问题免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。1 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些?实验

9、所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组 织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片 是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片， 有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对 组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标 本制作方法。2 2、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分 抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 所以要求在进行 IHC 染色时，需要先进行抗原修复或暴露

10、，即将固定时分子之间所形成的交联破坏， 而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是 pH6.0 的 0.01 mol/L 的柠檬酸盐缓冲 液。3 3、免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法， 免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一 种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素 抗生物 素染色法最常用。-可编辑修改-4 4、抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼 硅酸玻璃。如储存的抗

11、体中蛋白浓度很低(10-100mg/L),就应另加隔离蛋白以 减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%勺牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在 4C-8C条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗 体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于 -20C条件下，并避免反复冻融。冷 冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细 菌污染，可于抗体溶液中加入 0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20C以下 可保存3-5 年。保存稀释后的单抗应加入 0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进 行

12、冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当， 可在 4C下保存数月。多聚赖氨酸溶液(Poly-L-Lysine Solution多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。适用 组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防 实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。操作步骤（可直接在玻片上涂布）-可编辑修改-1.灭菌的 ddH20 1:10 稀释该多聚赖氨酸溶液。2.用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26C3.将玻片浸在稀释的

13、多聚赖氨酸溶液5 分钟。注意增加时间不会提高包被效果。4在 60C烘箱 1 小时干燥，或室温 18-26C过夜干燥待用。注意1.每 100mL 已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90 张，超过 90 张片子将影响其黏合力2.用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。4.释过的多聚赖氨酸溶液要放在 2-8C，至少在 3 个月内是稳定的。5.用过的稀释液要过滤，若岀现浑浊或长菌要丢弃。免疫组化的经验总结（2）-操作规程（一）、仪器设备 1） 18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二八试剂1）PBS 缓冲液（pH7.27.4）: NaCl 137m

14、mol/L, KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000m）:柠檬酸三钠 3g, 柠檬酸0.43） 0.5mol/L EDTA 缓冲液（pH8.0）: 700ml 水中溶解 186.1gEDTA 2H2O，-可编辑修改-用 10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0 加水至 1000m。4） 1mol/L 的 TBS 缓冲液（pH8.0）:在 800ml 水中溶解 121gTris 碱，用 1N 的HCl 调至 pH8.0 加水至 1000m。5） 酶消化液：a 0.1

15、%胰蛋白酶液：用 0.1%CaCl2（pH7.8）配制。b、0.4% 胃蛋白酶液：用 0.1N 的 HCI 配制。6） 3%甲醇-H2O2 溶液：用 30%H2O2 和 80%甲醇溶液配制。7） 封裱剂：a 甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合；b、油和 TBS（或 PBS 配制。8） TBS/PBS pH9.09.5,适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4 适合于光学 显微镜标本。（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60 分钟或 60C恒温箱中烘烤 20 分钟。1） 组织芯片置于二甲苯中浸泡10 分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟；2

16、） 无水乙醇中浸泡 5 分钟；3） 95%乙醇中浸泡 5 分钟；4） 70%乙醇中浸泡 5 分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复（1） 高压热修复 在沸水中加入 EDTA （pH8.0 ）或 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0 ）。盖 上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡 5 分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2） 煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0 ）至

17、95C左右，放 入组织芯片加热 1015 分钟。（3） 微波热修复 在微波炉里加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0 ）至沸腾后将组织芯片 放入，断电， 间隔 510 分钟， 反复 1-2 次。 适用的抗原有： AR， Bax, Bcl-2， C-fos， X-jun， C-kit，C-myc，E-cadherin，p53，p34，p16,p15,P-glycoprotein，PKC，PR, PCNA , ras，Rb，TopoismeraseH等。是以高温，高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。甲醛和蛋白水解交联过程中

18、氨基酸侧链上的某些-可编辑修改-基团（抗原决定簇）如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120C高温或强碱处理后，可使交联打开。2）酶消化方法 常用 0.1%胰蛋白酶和 0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37C，切片也预热至 37C，消化时间约为 530 分钟；胃蛋白酶消化 37C时间为 30 分钟。适用于被固定遮避 的抗原，其中有：Collagen, Complement, Cytokeratin , C-erB-2, GFAP , LCA , LN 等。3、免疫组织化学染色SP 法 1）脱蜡、水化；2） PBS 洗 23 次各 5 分钟；3） 3%H2O2 （ 80%甲醇）滴加在 TMA

19、上，室温静置 10 分钟；4） PBS 洗 23 次各 5 分钟；5） 抗原修复；6） PBS 洗 23 次各 5 分钟；7） 滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体。8） 滴加I抗 50 卩 l，室温静置 1 小时或者 4C过夜或者 37C1 小时。9） 4C过夜后需在 37C复温 45 分钟。10） PBS 洗 3 次各 5 分钟；11） 滴加H抗 4050 卩 l,室温静置，或 37C1 小时；12） II 抗中可加入 0.05%的 tween-20。13） PBS 洗 3 次各 5 分钟；14） DAB 显色 510 分钟，在显微镜下掌握染色程度；15） PBS 或自来

20、水冲洗 10 分钟；16） 苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；17） 自来水冲洗 1015 分钟；18） 脱水、透明、封片、镜检。SABC 法 1）脱蜡、水化。2）PBS 洗两次各 5 分钟。3）用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的 3%H2O2，室温封闭 510 分钟，蒸馏水洗 3 次。4 肮原修复。5）PBS 洗 5 分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体。7）滴加I抗，室温 1 小时或者 4C过夜或者 37C1 小时（4C过夜后在 37C复温 45 分钟）。8）PBS 洗三次每次 2 分钟。9）滴加生物素化二抗，20C37C20 分钟。10） PBC 洗 3 次每次

21、 2 分钟。11） 滴加试剂 SABC, 20C37C20 分钟。12） PBS 洗 4 次每次 5 分钟。13）DAB 显色： DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14） 蒸馏水洗。苏木素复染 2 分钟、盐酸酒精分化。15） 脱水、透明、封片、镜检。-可编辑修改-免疫组化的经验总结（3）-操作要点和技巧1.1.固定：最好用 4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。Bouin S 固定液：饱和苦味酸 750ml，甲醛 250ml，冰醋酸 5

22、0ml，其对组织的穿透力较强，固 定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的 长期保存。PLP 液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微 结构及许多抗原的抗原性保存较好。2.2.组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。3.3.切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。4.4.烤片：60C30 分钟或 37C过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。5.5.蜡块及切片的保存：最好在 4C保存6.6.脱片问题：Poly-L-Lysine （多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作

23、中最常用的一种防脱片剂，6ml 的多聚赖氨酸溶液可按 1:10 稀释成 60ml 的工作液，适合于需要酶消化、微波、 高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES 和 Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1 : 50 丙酮溶液中浸泡 3 分钟，晾干，即可进行下一步。7.7. 灭活内源性酶：HRP 系统：3%双氧水灭活；AP 系统：3%HAc 灭活。& &暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助 于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度（不同抗体的最佳修复液请参

24、阅抗体说明书）。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热 修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。9 9封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10.10.抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于 PBS 稀释的抗体一定要当天使用。11.11. 背景高：在抗体浓度、 反应时间、 反应温度等合适的条件下， 如果背景依旧高， 可 采用含 1%0 Tween20的 PBS 洗，特别是在显色之前要多洗。12返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或 Na2HPO4 的饱和溶液返蓝。13.显色：一定要在显微镜

25、下观察，注意控制背景。DAB 法显示过氧化物酶原理 过氧化物酶分解 H2O2 的过程中，下面反应不直接发生：AH2 （供氢体）+H2O2 A（供氢体的氧化物）+2H2O2 实验可知，有称为复合物I、H、皿、的酶一一底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化 学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。免疫组化染色步骤（以 ABC 法为例）溶液的配置：-可编辑修改-1. 0.1M PBS 2000ml: NaCL 18g, NaH2PO4 2H2O 0.8g, Na2HPO4 12H2O 12g.共六份2. 柠檬酸盐缓冲液：

26、贮存液：0.1M 柠檬酸溶液（A）: 21.01g 柠檬酸+ 1L 蒸馏水0.1M 柠檬酸三钠溶液（B）: 29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水工作液：9ml A 液+41ml B 液+450ml 蒸馏水 0.01M 柠檬酸盐缓冲液3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 纯甲醇充分混匀4. 20% 甘油：80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水5. 稀释抗体：1 : 300 , 1 : 400 , 1 : 600 （临用前配）6. 酒精的配置染色步骤：一步法1. 载玻片烤箱中 60C40。2. 二甲苯I, 60C20（水浴箱中），二甲苯H,室温 15。3. 脱水，100%95%T85% f 75%酒精，每级