第十一章糖的分析ppt课件

1、生命科学与生物医学工程罗云敬一糖类的存在与来源一糖类的存在与来源糖是自然界分布很广的一类化合物，几乎糖是自然界分布很广的一类化合物，几乎一切的动物、植物和微生物体内都含有一切的动物、植物和微生物体内都含有糖类。糖类。 地球上糖类物质的根本来源是绿色细胞进地球上糖类物质的根本来源是绿色细胞进展的光协作用。展的光协作用。1可作为生物体的构造物质，如纤维素。可作为生物体的构造物质，如纤维素。2可转变为生命所必需的其它物质，如脂可转变为生命所必需的其它物质，如脂类、蛋白质等。类、蛋白质等。3是生物体主要的能量来源。是生物体主要的能量来源。4可作为细胞识别的信息分子。可作为细胞识别的信息分子。 糖也称碳

2、水化合物糖也称碳水化合物carbohydratecarbohydrate，用，用Cm(H2O)nCm(H2O)n表示。表示。碳水化合物这个称号并不确切，但因沿用已久，所以致今在碳水化合物这个称号并不确切，但因沿用已久，所以致今在西文中还广泛运用。西文中还广泛运用。 糖是多羟醛或多羟酮及其缩聚物和某些衍生物的总称。糖是多羟醛或多羟酮及其缩聚物和某些衍生物的总称。 CH2OH(CHOH)nCHOCH2OH(CHOH)nCOCH2OH多羟基醛多羟基醛多羟基酮多羟基酮n寡糖与多糖的构造复杂：三个一样的氨基酸只能构成一种方式的三肽，而三个一样的己糖却能构成176种异构体！n丈量的构造包括：n分子量n糖链

3、中糖残基的种类和数量n糖残基结合的位置-衔接点n构型早期测定方法：早期测定方法：显色分析法显色分析法滴定分析法滴定分析法基于比重的分析法基于比重的分析法现代分析法：现代分析法：自动化液相色谱法自动化液相色谱法流动注射分析流动注射分析离子色谱离子色谱毛细管电泳分别分析法毛细管电泳分别分析法核磁共振核磁共振质谱分析法质谱分析法单糖：单糖：寡糖：寡糖：多糖多糖是构成各种糖分子的根本单位，是构成各种糖分子的根本单位，按其分子中所含碳原子的数目，按其分子中所含碳原子的数目，又分为丙、丁、戊、己和庚糖。又分为丙、丁、戊、己和庚糖。由由26个单糖缩合而成，二个单糖缩合而成，二糖最为重要，如麦芽糖、蔗糖最为重

4、要，如麦芽糖、蔗糖。糖。由多个单糖分子缩合失水而成的由多个单糖分子缩合失水而成的高分子聚合物，分子量很大，如高分子聚合物，分子量很大，如淀粉和纤维素等。淀粉和纤维素等。结晶、结晶、溶于水溶于水、具有、具有甜味甜味不溶于水不溶于水，无甜味，无甜味 单糖的命名：单糖的命名：普遍以来源命名，假设糖、木糖、和葡萄糖普遍以来源命名，假设糖、木糖、和葡萄糖。其中以五碳糖和六碳糖最为重要。其中以五碳糖和六碳糖最为重要。D-D-葡萄糖葡萄糖CHOHHOHHOHHCH2OHCH2OHHHOHHHHOHOCH2OHHHOHHHOHHOD-2-脱氧核糖脱氧核糖b-D-2-b-D-2-脱氧核糖脱氧核糖a-D-2-a-

5、D-2-脱氧核糖脱氧核糖HHHOHHOHHOCH2HOHOHOCH3OHHClHHHOCH3HOHHOCH2HOHOHOa-D-(+)-a-D-(+)-葡萄糖葡萄糖a-D-(+)-a-D-(+)-甲基葡萄糖苷甲基葡萄糖苷五碳糖核五碳糖核 糖糖糖糖 苷苷 键键n淀粉淀粉n直链淀粉直链淀粉 分子量约分子量约1万万-200万，万，250-260个葡个葡萄糖分子，以萄糖分子，以14糖苷键聚合而成。糖苷键聚合而成。呈螺旋构造，遇碘显紫蓝色。呈螺旋构造，遇碘显紫蓝色。n支链淀粉中除了支链淀粉中除了14糖苷键构成糖链糖苷键构成糖链以外，在支点处存在以外，在支点处存在16糖苷键，分糖苷键，分子量较高。遇碘显紫

6、红色。子量较高。遇碘显紫红色。一一 羰基的反响羰基的反响是糖许多定性和定量分析方法的根底是糖许多定性和定量分析方法的根底复原法：复原法：糖类化合物的醛基和酮基在溶液中以游离和烯糖类化合物的醛基和酮基在溶液中以游离和烯醇两种方式存在，烯醇式糖类是具有一定活醇两种方式存在，烯醇式糖类是具有一定活性的复原剂。性的复原剂。最常见的复原反响是将最常见的复原反响是将Cu2+复原为复原为Cu+，在碱，在碱性溶液中构成黄色性溶液中构成黄色CuOH，在加热的情况下继，在加热的情况下继续转化为不溶性续转化为不溶性Cu2O 。在严厉控制实验条件的情况下，在严厉控制实验条件的情况下， Cu2O Cu2O生成量的多生成

7、量的多少可以作为糖量多少的定量目的。少可以作为糖量多少的定量目的。 Cu2O Cu2O的量可以的量可以经过其复原磷钼酸到深蓝色钼蓝进展定量，其吸收经过其复原磷钼酸到深蓝色钼蓝进展定量，其吸收波长在波长在700700750nm750nm。烯醇式烯醇式n醛糖和酮糖与芳香胺的反响n醛糖和酮糖在冰乙酸中与不同的芳香胺发生缩合反响生成有色物质。n常用的芳香胺有邻茴香胺、对氨基水杨酸、对氨基苯甲酸、二苯胺和对氨基苯酚等。n芳香胺类化合物对于某一种或者某一类的糖的反响具有选择性。n但是芳香胺类化合物具有致癌性不适宜于实验室运用。n与强酸和酚的反响：与强酸和酚的反响：n戊糖和己糖与强酸和酚一同加热，戊糖和己糖

8、与强酸和酚一同加热，反响时会分别产生呋喃或羟甲基呋反响时会分别产生呋喃或羟甲基呋喃衍生物，醛基然后与酚缩合产生喃衍生物，醛基然后与酚缩合产生有颜色的化合物有颜色的化合物糖糖 糠醛或糠醛衍生物糠醛或糠醛衍生物 紫色紫色 浓浓HCL或或H2SO4脱水脱水- 萘酚萘酚己酮糖己酮糖 羟甲基糠醛羟甲基糠醛 红色红色 浓浓HCl, 脱水脱水间苯二间苯二酚酚n化学分析法：n寡聚多糖与碘的反响可以作为一些多糖定性分析的根底n碘与淀粉 蓝色n碘与糖原和糊精 红色n碘与纤维素 无色n过氧化反响过氧化反响n糖类被强氧化剂如高碘酸氧化时，碳链糖类被强氧化剂如高碘酸氧化时，碳链会发生断裂会发生断裂CHOOHHCH2OH

9、HIO4HCO2H+HCO2H+HCHOpH5.0pH5.0条件下参与高碘酸钠于条件下参与高碘酸钠于44进展进展2424小时，然后参小时，然后参与乙二醇破坏过量的高碘酸。经过所耗费的高碘酸的与乙二醇破坏过量的高碘酸。经过所耗费的高碘酸的量可以推测多糖分子中所存在的相邻羟基的数目。反量可以推测多糖分子中所存在的相邻羟基的数目。反响中所耗费的高碘酸可以经过滴定或光谱法测定。响中所耗费的高碘酸可以经过滴定或光谱法测定。n质谱分析法：质谱分析法：n关键问题是离子化：快原子轰击关键问题是离子化：快原子轰击FAB)、电喷雾离子化、电喷雾离子化ESI)和基体协助激光和基体协助激光解吸离子化解吸离子化MALD

10、I)软电离技术都适软电离技术都适用于糖类分析。用于糖类分析。n飞行时间质谱飞行时间质谱TOF-MS)和傅立叶变换和傅立叶变换质谱质谱FT-MS)测大分子糖的分子量要比测大分子糖的分子量要比光散射法或凝胶浸透法精度高得多，特光散射法或凝胶浸透法精度高得多，特别是别是LC/MS和和MS/MS分析法更有用。分析法更有用。 MALDI-TOF/MS用于丈量寡糖的分子量，源后衰减技术Postsource Decay, PSD)用于测寡糖构造。 最有效的方法还是MALDI-FT-MS/MS法。n步骤步骤n酶降解糖复合物，切割寡糖链；酶降解糖复合物，切割寡糖链；nHPLC分别纯化分别纯化n质谱分析质谱分析n

11、得出结论后，用其他方法核证，如得出结论后，用其他方法核证，如GC/MS,MS/MS和和NMR等等n当化学分析法达不到分析特异性的要求，采用酶分析法n通常可以在各种异构体的混合物中实现对某一种的选择性测定，并能区分和构型n常用的酶： -半乳糖苷酶、-葡萄糖苷酶、 -半乳糖苷酶等n-D-D-葡萄糖葡萄糖+O2+H2O D-+O2+H2O D-葡糖酸葡糖酸+H2O2+H2O2n-D-D-葡萄糖被氧化的反响速率低于葡萄糖被氧化的反响速率低于-D-D-葡萄葡萄糖的糖的1%1%n-D-D-葡萄糖与葡萄糖与-D-D-葡萄糖两种异构体以平衡葡萄糖两种异构体以平衡的方式存在，在变旋酶的作用下的方式存在，在变旋酶

12、的作用下向向不断转不断转化，最终使得反响进展完全。化，最终使得反响进展完全。n基于显色反响的过氧化氢分析基于显色反响的过氧化氢分析n上述反响所产生的过氧化氢可以用显色法测定，最上述反响所产生的过氧化氢可以用显色法测定，最早用的底物为邻早用的底物为邻-连甲苯胺和邻连甲苯胺和邻-茴香胺，但是具有茴香胺，但是具有致癌性，已被取代。致癌性，已被取代。n但是要留意防止过氧化物酶的干扰，它可以使过氧但是要留意防止过氧化物酶的干扰，它可以使过氧化氢变为水和氧气。化氢变为水和氧气。n基于电化学的过氧化氢分析基于电化学的过氧化氢分析n是葡萄糖分析仪的根底是葡萄糖分析仪的根底n分析速度快，一分钟之内就可以完成，而

13、且试剂及分析速度快，一分钟之内就可以完成，而且试剂及样品的耗费少样品的耗费少10l。n葡萄糖脱氢酶葡萄糖脱氢酶n-D-葡萄糖葡萄糖+NAD+/NADP+ 葡萄糖葡萄糖酸内酯酸内酯+NADH/NADPHn利用动力学法或固定时间法测定产物利用动力学法或固定时间法测定产物NADH在在340nm处的吸收处的吸收n分析时要用变旋酶加速分析时要用变旋酶加速型向型向型型D-葡萄葡萄糖的变化糖的变化葡萄糖脱氢酶n己糖激酶葡萄糖葡萄糖+ATP己糖激酶葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸+ADP葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸+NADP+G-6-P脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+己糖激酶对于普通帖并不具有专注

14、性，但是第二个反响对葡萄糖-6-磷酸具有很高的专注性。甘露糖甘露糖-6-磷酸磷酸果糖果糖-6-磷酸磷酸葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸+NADPH甘露糖甘露糖果糖果糖葡萄糖葡萄糖己糖激酶己糖激酶+ATP己糖激酶己糖激酶+ATP己糖激酶己糖激酶+ATP利用己糖激酶分析甘露糖、果利用己糖激酶分析甘露糖、果糖、及葡萄糖的原理，检测在糖、及葡萄糖的原理，检测在340nm340nm处。处。PhNHNH2D-果糖D-甘露 糖D-葡 萄糖葡 萄糖脎3 脎：黄色晶体，有固定熔点和固定晶形，成脎时脎：黄色晶体，有固定熔点和固定晶形，成脎时间不同，可用来鉴别醛酮间不同，可用来鉴别醛酮 三种果

15、糖具有一样的烯醇式，所以成脎的产物完三种果糖具有一样的烯醇式，所以成脎的产物完全一样全一样n糖的样本普通溶于异丙糖的样本普通溶于异丙醇中，质量浓度大约为醇中，质量浓度大约为2g/L2g/L，点样量普通为，点样量普通为10l10ln定义葡萄糖的定义葡萄糖的RfRf值为值为100100n分别之后普通要经过显分别之后普通要经过显色反响以确定糖的位置色反响以确定糖的位置，运用不同的显色剂有，运用不同的显色剂有助于未知斑点的鉴定助于未知斑点的鉴定n显色是采用喷雾或浸入显色是采用喷雾或浸入，在，在100100下加热下加热5 51010分钟分钟n当要鉴定或定量一种或多种糖类化合物，特别是量比当要鉴定或定量一

16、种或多种糖类化合物，特别是量比较小时，用气相或液相色谱法较小时，用气相或液相色谱法n可以分别构造非常相近的糖类化合物可以分别构造非常相近的糖类化合物n糖类需衍化为挥发性衍生物后方可用气相色谱法，常糖类需衍化为挥发性衍生物后方可用气相色谱法，常见的衍生物类型有见的衍生物类型有o-三甲基硅三甲基硅TMS) 。 1阿拉伯糖arabinose;2.半乳糖galactose;3.葡萄糖glucose;4.甘露糖mannose羊肚菌多糖的气相色谱图羊肚菌多糖的气相色谱图 可以看出可以看出, ,羊肚菌多糖羊肚菌多糖MEP-SP2MEP-SP2是由甘露糖、葡是由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖残基为反复单元组成萄糖、阿拉伯糖和半乳糖残基为反复单元组成的的, ,摩尔比为摩尔比为1.754.130.710.681.754.130.710.68n不需求衍生为气化物质不需求衍生为气化物质n用分配或者离子交换色谱分别，检测运用分配或者离子交换色谱分别，检测运用紫外或折光率检测器用紫外或折光率检测器n通常运用键合固定相，以反向色谱方式通常运用键合固定相，以反向色谱方式分别，洗脱用乙腈和水分别，洗脱用乙腈和水80：20，其，其中含中含0.1mol/L的乙酸。的乙酸。n用化学衍生法为糖类带上具有紫外吸收或发荧光的基团：复原氨基化n多数糖分子在通常情况下难以电离，经过衍生化其电离才