MET基因复制数量的增加赋予单克隆抵抗体抗MET的能力并且建立药物依赖性

1、ME厘因复制数量的增加赋予单克隆反抗体抗MET的水平并且建立药物依赖性关键词：MET, MV-NV3曲克隆抗体,酪氨酸激酶抑制剂,抗性,药物依赖性【摘要】：被MEI原癌基因编码的酪氨酸激酶受体领导了具体抑制剂的开展并在 癌症中起很重要的作用,其中现在一些正处于前进的临床试验阶段就以前的经验 说明对大多数靶向治疗最主要的限制是抗性的出现.在对MEW克隆抗体抗性和抗体对化学抑制剂旁路抗性反之亦然一无所知时,酪氨酸激酶抑制剂对MET的抗性机制就已经被提出.EBC1®肺癌细胞是METS因扩增的结果,并且这种 细胞对METW制剂非常敏感,包括MEW克隆抗体的单机形式在内.我们培养生 成反抗抗体

2、的细胞发现这种抗性是由于 MET!因大量复制扩增和它的受体显著 表达而来.这种过度表达可以使单克隆抗体的“脱落活动到达饱和,并且能够 预防外表的METg体的有效的下调和抑制剂的活化作用.值得注意的是MV-DN30 抗体的抗性细胞是METW受细胞对MET1氨酸激酶抑制剂也很敏感.除此之外, 抗体抗性细胞还具有药物依赖性,MV-DN30的去处导致它们死亡是由于它们的过 度信号表达.在实验中,对MET各氨酸激酶抑制剂存在抗性的细胞仍然对 MV-DN30 抗体的作用敏感.结果说明一种不连续的通过抗体和化学激酶抑制剂联合治疗可 能会使靶向治疗的临床反响和对 METK体治疗旁路的抗性增加.缩略语：MV-D

3、N30-即彳D DN30 TKEs-酪氨酸激酶抑制剂,HG1肝细胞生长 因子,MAPK有丝分裂原活化蛋白激酶1 .简介可以抑制一个特定的目标分子化合物的靶向治疗法开辟了治疗癌症的新道 路.与主要杀死扩散细胞为主的传统化疗不同的是靶向药物对月中瘤细胞采取一种 更具体的治疗方式.靶向治疗依赖于“癌基因沉瘾的概念.这就意味着单个基 因的抑制或死亡是由于它们的沉瘾, 或者至少抑制它们的生长温斯坦,2002. 临床试验中的特定抑制剂的开展给月中瘤细胞的“ Achille ' s heel 的识别提供 支持温斯坦和乔,2006.尽管靶向治疗在一局部癌症患者中取得了较优异的效果,还有重要的一点就 是

4、局部癌症病人对药物的选择表达没有起到治疗作用原发性,除此之外,几 乎总是一开始患者反响变成后来对治疗的反抗和复发继发性.因此,最关键 的就是要发现对治疗反抗的机制并且找到绕过它们的方法.癌基因和人类癌症密切相关,酪氨酸激酶起着决定性作用.这个观察发现许 多月中瘤沉溺其中使得蛋白激酶成为了治疗癌症的理想目标巴塞尔加,2006;Gschwind等人,2004.在临床诊断中主要使用一种较小的激酶抑制剂和单克 隆抗体来抑制酪氨酸激酶.酪氨酸激酶抑制剂是一种可以抑制靶蛋白酶活性的小 分子物质.它们能有效地瞄准膜结合位点和细胞内的激酶并且很容易在体内扩 散.单克隆抗体已被广泛用于临床并取得了可观的成果.这

5、些分子的优点在于它们具有很高的特异性.在癌症治疗中的可以抗癌的 RTKs单克隆抗体已经被批准 在乳腺癌和结肠癌中使用分别针对HER2W表皮生长因子受体并可作为抗血 管增生的药物针对血管内皮生长因子受体.除此之外,很多针对于其他目标 的单克隆抗体正处与开展和试验阶段. 最近,一种作为癌症治疗目标的RTK受到 关注,这种RTKg由致癌基因编码的在肝细胞生长因子上的酪氨酸激酶受体.在和肝细胞生长因子结合后,MET舌化并启动一个复杂的生化程序,这个过程被称 作“浸润性上长.在月中瘤组织中,浸润性生长的增进可以迫使月中瘤细胞从月中瘤 组织中分解下来侵蚀基底膜,渗入基质中,甚至定居于新的组织中来实现转移.

6、很多研究结果说明METS人类的许多月中瘤中具有活性,并且它与对直接激酶疗法 的持续抗性密切相关.除此之外,还说明细胞显示大量复制超过 8张和随之 而来的过度表达和独立配体的激活都是沉溺于这种致癌基因和抗MET®物的应答中.在前期设置得到的根本结果,几种特定的多目标的酪氨酸激酶抑制剂和直 接针对于MERE者HGF勺抗体已经进入了临床试验阶段.在活体和动物模型进行 的研究已经说明用TKIs长期治疗会导致机体的治疗耐受性. 对METTKIs的抗性 可能是由于一些机制,比方 MET1因扩增,过度表达,MET点突变,MET¥行路 径的激活和KRASS因的扩增机制.然而,关于对 MET

7、勺单克隆抗体的再次具有 抗性一无所知.我们以前报道过主要针对细胞外的局部 METB抑制性单克隆抗体的研究进 展.它的诱导、再结合、到达MET兑落阈值的水平使其有抑制活性,剩余的跨膜 片段通过蛋白酶体降解途径处理掉.因此,DN-30结合到MET®的结果是使其变 成可溶性的诱饵ME巾且蛋白水解酶会讲解 MET®酶.这促进了 MET导的生 物活性的抑制作用.设计了这样一个过程就是由于 DN-30的结合使得MET敢酶部 分活化并且导致抗体介导的受体同源二聚体化和单价Fab片段失去竞争活性的一个过程.在这个研究中我们说明了不断用 MV-DN3宠治疗沉瘾癌细胞会使其具有抗 性的原因是M

8、ETS因的大量复制和MET勺过度表达超过了 MV-DN30寸其有效下调 并使其失去活性的的水平.值得注意的是,MV-DN3抗性细胞还会一直对METTKIs 产生耐受性和敏感性.有趣的是,它们获得了药物耐受性,当受到MV-DN30勺驱 除致死它们的是过多的信号表达.我们还说明对 MET TKIs有抗性的细胞也对 MV-DN3瞰感,所以,MV-DN3序口 MET TKIs对月中瘤细胞的作用是相互促进的.2 .材料与方法2.1. 细胞和试剂EBC1细胞从一个患有转移皮肤月中瘤的病人取得,这个患者还患有肺鳞状细 胞癌,病例是从日本癌症资料库购置得到.GTL16是一种实验室里的克隆胃癌细胞系.HEK-2

9、93T®胞系别离于人类胚胎时期的肾,A549细胞系来源于肺癌, 都是从ATCC勾买来培养的.对MV-DN30t抗Tt的EBC1细胞可以通过一个逐步的 方法培养得到,由Sigma Tau R&D提供的通过暴露亲代细胞方法来增加抗 MET 单价单克隆抗体的浓度.亲代细胞用 10 mg/ml的MV-DN30台疗约一个月,直到 生成的R10细胞开始产生抗性为止,R10抗性细胞又用逐步增加浓度的 MV-DN30 治疗.所有的抗体耐受细胞培养在存在 MV-DN3/且可以使它们产生耐受性的条 件下.大约两个月可以别离到R20抗体抗性细胞,四个月可以别离到R80抗体耐 受细胞.EBC1 an

10、d GTL16细胞对 MET TKIs PHA-665752 (EBC1 RPHA 50 nM and GTL16 RPHA 150 nM)都有耐受性,并且向描述的那样培养可以一直保持 PHA-665752的存在.该细胞系的遗传身份通过一个短的申珠状重复序列( STR 识别,这段序列在2021年7月再次重复出现.We我们利用下面的小分子：ATP 竞争行 METTKIs PHA-665752(Tocris Bioscience) and JNJ-38877605 (John-son & Johnson)和 p38MApt酶抑制齐1J SB203580 (Merck).2.2. mRNA和

11、基因组DNA勺分析用Trizol试剂提取得到的RN徽检测到利用多文士病毒的逆转录酶和随机 引物合成,cDNA以用实时的利用电源带动的绿色 PCR昆合的PCR技术来实现 扩增,根据制造商的说明下面的 METK ACTIN特异性引物要用到：hMET ex 19 Fw: 50-AGTTTACCACCAAGTCAGATGTGT-30; hMET ex 20 Rw: 50-GGGCTCCTCTTGTCATCAGC-3;hACTIN Fw: 50-GGAGGAGCTGGAAGCAGCC-30;hACTIN Rw: 50-GCTGTGCTACGTCGCCCTG-30.根据制造商的说明用实时PCFfe术来分析

12、用纯化的DNAS因组迷你试剂盒分 析从细胞中提取到的基因组DNA这种技术是用TaqMan基因表达的主要结构和 TaqManR车+METS因和RNaseP空制基因的实时定量 PCR析.MET勺mRNA勺成 倍增加和EBC1中METS因的大量复制以及MV-DN3抗性细胞归一化然后被认可.2.3. 蛋白印迹分析和脉冲追踪代谢标记蛋白提取液(40 mg),细胞上清液(20 ml).在细胞裂解前2小时把METTKI JNJ-38877605参加到指定的地方.免疫印迹法使用了以下的初级抗体：theanti-MET Intracellular domain (ICD) (zymed, #370100) fr

13、om Invitrogen, anti-MET ECD (DL21) obtained as described ( Prat et al., 1991), anti-phospho-Tyr1234-Tyr 1235MET (#3126), anti-AKT (#9272), anti-phospho-Ser473AKT(#4060),anti-p44/42MAPK(#9102),anti-phospho-Thr 202-Tyr204P44/42MAPK#9101),anti-p38MAPK(#8690),anti-phospho-Thr180-Ty r182-p38 MAPK (#9215)

14、, from CellSignaling;anti-vinculin (#V9131) from Sigma and anti-b-actin (#I-19 sc-1616) from Santa Cruz Biotechnology. Secondary IgG HRP-Peroxidase antibodies were from Amersham.脉冲追踪实验的1106WT或MV-DN3抗性的EBC1ffl胞(R80)者B被平铺在60mm 的盘里.R80细胞保存在有或没有抗体(80 mg/ml)存在的条件下,而 WT细胞 要一直保存在有抗体的条件小16小时.然后,这些细胞在不含 L-蛋氨

15、酸但有 500mmMCIL-硫氨酸S35(脉冲)(易标记)的DMEM1养基中处理20分钟.在这 之后,去处放射性标记的培养基,细胞用1ml磷酸盐缓冲液盐水洗两次然后保存 在有2mlISCOVE勺培养基中,培养基中参加 2%FBS在MV-DN30(80 mg/ml)存在 或不存在脉冲3.6和16小时.之后,用免疫沉淀法(IP)在1ml细胞裂解液中 进行测定(裂解缓冲液：1%ThtonX-100 存在下,20 mMTris-盐酸,5毫米EDTA 10%V / v甘油,150 mMNaCl补充蛋白磷酸酶抑制剂)通过使用抗 Met ICD dq13单克隆抗体,而IP法利用抗Met ECDdo24单克隆

16、抗体对细胞培养2毫升上清液 进行.细胞裂解液和上消液都在有抗体的培养基里培养16个小时,抗鼠IgG抗体预包被琼脂糖凝胶蛋白珠形成免疫复合物沉淀下来.免疫沉淀物中的蛋白就会被8%SDS-PAG分开,然后转移到3mmi勺纸上,80度,48小时后蛋白质的放 射性就会在投影膜上留下印记.2.4. 生长和可行性分析用于细胞生长和可行性分析的这些细胞被接种在96孔的培养板上,根据制造商的说明用药物在不同时期进行处理然后用细胞滴度发光细胞进行可行 性分析.没经过处理的细胞限制在药物载体存在的条件下生长.所有的数据进行归一化到0天的药物治疗.2.5. 荧光细胞分析对结合在EBC1WT,R20,R8削胞质膜上的

17、MET1行免疫荧光着色,这些细胞 要提前在有或没有MV-DN3呼在的条彳下培养24小时.荧光性的强度可以通过 细胞荧光性分析检测到.用于检测的细胞要在PBS中用2%FB觥涤并且在室温下 用抗MET ECD DO24 mAb (100 ng/ml)着色20分钟.然后在室温下细胞又在 PBS 中用2%FB就涤就会逐步产生抗鼠IgG-RPE二抗然后用二月米基苯基呷珠作用20 分钟.作为阴性对照,将不含初级抗METK体的细胞进行染色.质膜结合的蛋氨 酸的荧光强度(AU为单位),通过使用GraphPad Prism软件绘制为箱形绘图图2.6. 慢病毒载体转导EBC1 WT细胞能稳定地在两种不同量的慢性病

18、毒颗粒编码的MET cDN专导,包括Img(METtt)和1.6mg(METttt)的p24病毒抗原,其浓度按说明确定.作为对 照,WTM胞用含有空载体病毒颗粒感染.MV-DN30%性细胞(R20 and R80)只用空载体感染.在感染48小时后接种细胞用于生物化学分析.转导细胞的可行性 分析如先前描述的一样进行,让细胞在存在或不存在MV-DN30勺条件下上长72小时.如先前所述,MET勺蛋白印迹分析和磷酸化的 METS白水平和对感染细胞 的mRNA勺表达水平实时定量PC的析一样子细胞感染72小时后进行评估.2.7. 药物协同作用分析在抗METB体MV-DN3年口 METTKI JNJ-388

19、77605之间进行药物协同作用分析 是对WTEBC侪口接种在96孔板上的GTL16细胞在用药物治疗72小时后的细胞活 力的研究.如果使用一个药品从药物剂量来说要比混合使用的IC50约高10倍左右,双重增加浓度可以用于单药使用和组合使用.评估细胞活力为前面描述的增效作用的药物效应多种分析研究,采用组合指数( CI)和Chou and Talalay 方 法.使用相互排他性假设计算 CI值(药物作用机理的不同,采用compusyn.exe) 软件,可上线的网站：,和绘制功能的FA(由这两种药物的组合影响系统分数). CI值 1说明两种药物之间的协同作用.2.8. 统计分析同一个实验数据用Graph

20、Pad Prism软件进行两尾t检验分析至少有三种生 物学具有统计学显著意义的结果.P值小于0.05被认为是有意义的.3 .结果3.1. MV-DN30耐药细胞株的建立EBC1肺癌细胞是METM瘾细胞,它能放大MET勺扩增、过度表达和活化过程, METTKIs或者MV-DN301 EBC1细胞里的METM有强烈的破坏它们生存和上长的 水平的作用图AC.我们先前培养的EBC1细胞 对不同的YKIs有抗性说明了这种抗性可能是由于METS因的进一步扩增.为了产生抗MV-DN30勺细胞,我们采用逐步暴露EBC1原代细胞不方法来增加抗体的浓度,并且获得抗不同剂量抗体的细胞系图1b;约的分步方法详见材料和

21、方法局部.,进一步的实验中,我们使用耐20细胞ebc1 R20和80 ebc1 R80毫克/毫升mv-dn30,剂量是分别是前面的约 10倍和40倍,然后测这些细胞的抗体IC50 图1a.在有MV-DN30?在的抗性细 胞的生长速度一直和 WT细胞差不多图1C.正如前面提到的,MV-DN30g挥它的抑制活性是通过诱导 MET勺结构域蛋 白反正溶蛋白裂解,随后又通过蛋白酶体受体介导受体降解. 这种反响减少了细 胞外表的MET勺大量表达,抑制了 MET勺活性和受体介导的生物学活性.如图 1D所示,事实上,MV-DN30勺治疗导致了再EBC1细胞中的MET!过酪氨酸酶的 磷酸化消除大量减少.与抗性细

22、胞的生化分析相反的是显示了在相同剂量抗体存 在的情况下,MET&会磷酸化并且在质膜上的大量的 MET®白明显高于保存在相 同条件下的WTffl胞图1D,E.除此,尽管激活的下游目标 AKTft MAPK酶 都被保存在有抗体存在的条件下图 1D.所有的数据说明,抗EBC1细胞的MV-DN3/不是通过一种足以消除它的结构 的活性的方法来下调MET而是一种允许它的信号转导来调节它的结构磷酸化的 方法.3.2. 抗性细胞中缺乏MV-DN30卬制活性并不是由于它的活性缺乏如图1D,E所示,用MV-DN30t理抗性细胞致使ME伙量减少这种减少比处 于同等条件下观察的 WT细胞中的减少更明

23、显.我们想知道在抗性细胞里的抗体 受损是否是由于MET勺结才域IPT4发生突变引起,这个结构域是它的集合位点, 但是我们没有发现任何突变数据显示.于是,我们评估了是否是抗性细胞中脱落的 MET1外结才域ECD对抗体的反 应被抑制了.在相同剂量MV-DN30?在的条件下培养了 24小时的抗性细胞和WT 细胞的上清液中,抗性细胞上清液中含有更丰富的脱落的ECD图2A.当对去处抗体24小时后的抗性细胞中MET勺表达和活化进行评彳4时,我们观察到 MET 总量强烈增加特别是结合在细胞膜上的形式(图 2B和图1).对抗性细胞再引入MV-DN3隹田胞会导致上清液中MET EC沓量更高,与在同样剂量处理的

24、W1I田 胞相比,之后细胞内的METH时减少了并返回到平时观察的抗性细胞的一半水平(图2 D).在脉冲代谢标记实验中也观察到了相似的结果：比起WTI田胞,抗性细胞合成更多的METf口 MV-DN30B促进MET ECDS放并大量增加(图2E).最后,用更高剂量抗体20 mg/ml (R20)处理EBC1M胞来更女的证实MV-DN30 在抗性细胞中是具有活性的.图2F所示在抗性细胞中随着MV-DN30J量是增加 减少了大量MEM细胞膜上白表达(图2A)和磷酸化(图2B).总之,所有的结果说明EBC1细胞的抗性不是由于MV-DN30舌性缺乏,而是 由于用它的饱和水平来促进了一种高效的 METW离.

25、图1-抗MV-DN30勺EBC1细胞分子表征.(A)在有MV-DN30勺递增浓度的条件 下培养了 72小时的EBC1WT0胞的细胞活力.对未经过处理的细胞(100%) ± s.d.的归一化结果.(B)在指定浓度抗体的条件下培养 72小时的EBC1WTM胞或产 生MV-DN30%性的细胞(R10, R20, R40, R80).与未经过处理的 WTM胞(100%) ± s.d归一化结果.(C) 在MV-DN30(20 and 80 mg/ml)存在的条件下生长的 EBC1 WTM月fi EBC1R2仔口 R80细胞的生长活性.与未经过处理的 WT细胞(100%) ±

26、 s.d归一化结果*P < 0.001.D在有指定剂量MV-DN3抗体存在的条件下处理 24小时的EBC1WT ,EBC1R加 R80细胞的蛋白印迹.E结合MET勺在24小时 在不存在或存在的血浆膜的荧光强度的箱图 mv-dn30 R20和R80生长EBC1 WT 细胞AU:任意单位ICIDBX5uOE图2一细胞耐受性并不是由于失去了对 MV-DN301勺敏感性.A在存在或不存在 MV-DN30勺环境下培养24小时的EBC1 WTR20 R80细胞的上清液中 MET ECDj 蛋白印迹.B在有或没有24小时去除的EBC1WTR邸R80细胞中的蛋白顶 部和蛋氨酸的酪氨酸磷酸化蛋白印迹.纽蛋

27、白作为限制根底C在EBC1WT,R20 and R80细胞中有或没有24小时去除MV-DN30勺条件下在质膜上结合的 MET 的荧光强度的箱图.质膜着色如图 E.D在用MV-DN30t理24h的EBC1WT R20和R80细胞中和抗性细胞图2 D中观察到的MET总蛋白水平和METECD的 蛋白印迹.E 在有或没有 MV-DN34在下的EBC1W和R80细胞里的MET侬源 细胞裂解液,上面和乂£丁 ECD来源与细胞上清液,底部的用脉冲追踪代谢 蛋白标记法的免疫沉淀分析.F在递增MV-DN3脓度的环境下的EBC1任图 和R20细胞右图的活性检测.未经过处理的 WT细胞左图或者用20 mg

28、/ml 100%处理的 R20右图统计结果*P < 0.001, *P < 0.05.3.3. 对MV-DN30勺抗性是由于METB扩增和过度表达如上图所示图2BeD , MV-DN30%性细月fi表达ME冰平比原代细胞更高.我们疑心这可能是由于增加的启动子活性或更高的 mRN的可用性,由于你微RNA的负限制微分表达了.在EBC1WT抗性细胞的荧光素酶检测结果显示排除这些 可能性数据未显示.然后我们评估了基因扩增的情况是由于 METt量复制是对激酶抑制剂存在 抗性的机制.如图3所示,EBC航性细胞显示了 MET勺大量复制原代细胞的 第24代到30代,这大约是二倍体细胞的15倍.当分

29、析MET勺mRN冰平时, 我们观察到MET勺过度表达是 WH田胞的23倍,到达了 METE常表达细胞A549 and HEK-293T的6090倍.为了证实这种增加可能是为了维持对 MV-DN30勺抗 性,我们将EBC1WT胞放在不同量的 METcDNA件下转导,通过比拟 EBC1R20 和R80细胞mRNA勺表达水平来获得图3.我们观察到,MET勺mRN© 23 倍的速度剧增,这与在存在 MV-DN30勺条件下细胞的活性有关图3D.除此, 尽管有MV-DN30勺存在MET呆持磷酸化,这就解释了为什么细胞能够存活增加图 3E.所有实验结果说明,嗜MET勺EBC1细胞变得有抗性是由于M

30、ET勺进一步扩增 和过度表达从而来阻止有效的抗体介导的对 MET舌性的抑制.图3BDE- 20-210 -鹿口 -电口3.4. 抗MV-DN30勺细胞也是嗜MET细胞并有药物依赖性为了证实抗MV-DN30勺细胞也是嗜METM胞,我们用一种小分子的激酶抑 制齐ij JNJ-38877605来处理细胞.如图4a,b所示,抗MV-DN30勺EBC1细胞在有 抗体20 mg/ml for R20 and 80 mg/ml for R80存在的条件下生长情况显示了当用MET微酶抑制剂JNJ-38877605 10 nM or 250 nM处理时,细胞活性的降 低和ME僦酸化作用的减弱.和亲代 EBClf

31、fl胞相比,抗性细胞对JNJ-38877605 的敏感剂量更低,可能是由于在抗性细胞中MET勺蛋白合成和转运更高效.从抗性细胞的培养基中去除 MV-DN3g导致MET勺表达增加图2B, 我们研究了过度表达的生化效应.抗性细胞培养在不存在MV-DN30勺条件下,显 示了活性下降图4C.这些细胞的蛋白印迹分析说明,随着时间的推移逐渐 增加了磷酸化图4D 0然而,2448h后,after 24e48 h, p38 MAPK 的活化 清楚可见证实了通常在细胞凋亡反响之前会有一个细胞应激反响.除此之外,在没有MV-DN3/在的条件下培养的抗性细胞中的 p38 MAP0受到一种小分子 SB203580的抑

32、制使得细胞活性得以恢复图3.这些数据进一步说明,p38 MAPK 信号对于参与药物依赖是至关重要的.重要的是要记住对于嗜MET细胞抗MET各 氨酸激酶抑制剂的药物依赖条件和黑色素瘤有获得性的药物依赖性已经被证实.为了证实当去除MV-DN30f过多的METB号使细胞凋亡是正确的,我们用低 剂量的MET YKI处理抗性细胞让其充分减少但不会完全抑制MET舌性图4.事实上,如图4E所示,保存在不含 MV-DN3/用10 nM JNJ-38877605 低于 IC50浓度处理的抗性细胞可以恢复它们的活性,并且这种水平类似于保存在 有抗体存在的培养条件下的抗性细胞的活性水平o总之,这些结果说明,MV-D

33、N30%性细胞都是嗜METM胞并且它们的繁殖和 生存都有药物依赖性.图4A 口 fgW WMjUf oof.B cfcjrt condMtWVB 4 州纯KT7*05 " M% 口 adiure c；Md史©n* *JHJ41V77409 0mMUC II WT EJHC1 RZO EBC I R40M V ON3D Iwfnl , » M 40 W HJMJJMr?flO5#t'M| , 10 290 - 1i0 350 1l« 250O1W-UJLTfrom-UlSK&aE口 oJ1kjr« coriditiorre

34、1;-»¥ f 亲?工工心里士一占rfc * . IlJV nMm 7 = 3.5. 在嗜MET1田胞中MV-DN3伊口 MET TKIs的协同作用MET-TKIs和MV-DN30都可以有效的抑制EBC1细胞的活性,我们想知道这 两种抗ME讹合物是否表现增强或协同作用.单独或在有非常低剂量的MV-DN30 存在的条件下0.152.5毫克/毫升,从10倍以下的IC50开始,我们用逐步 增力口 METW制齐【J JNJ-38877605的方法来处理EBC1 WTffl胞.然后我们分析细胞 活力和对药物治疗的两种药物的组合效应的性质,利用多药效果分析.如图 5C 所示,联合治疗导

35、致的剂量尽可能低为 1.2520 nm jnj-38877605 在0.152.5 毫克/毫升mv-dn30存在活性降低.当在GTL16 WT胃癌细胞上做这个实验室会 得到相似的结果图5D.如图5A、B所示,多药效应分析说明了 EBC1and GTL16 WT窥胞的CI值都小于1,从而说明了 JNJ-38877605和MV-DN3必问有药物协 同作用.所有的这些数据说明用 MET TKI和MV-DN3瞅合治疗可以有效地减少嗜MET!田胞的活性,剂量明显低于单方4一种药物治疗的药量.图 5ABE BC1 R PH A 前7一三至 A二3GTLWRPHAPH Afr&k52 HMiiMl

36、kffV<)hlW'gjB2uiQ/ml 口 MV-iJN 30 15 pgattal MVONWIA/SiJB/ml 口 1V孙励£5国O MV-ON3A3.1J2S|jg/nil MV-DNW3pg|AiliilJNJ -3BB77005 LrealrmntG TL16 l¥T1.25 SW 卷 捕 好 相J HJ - MB7TOIS t tWifmint 杓即muM 碗珏 第一至.事可口4 .讨论临床效应甚至是最有效的靶向治疗都被开展的耐药性所限制.显而易见,这种耐药性机制已经被广泛研究.从癌细胞和抗酪氨酸激酶抑制剂说明,获得性耐药的 最常见的机制包括在

37、药物目标本身的二次突变的患者获得的数据,激活下游信号转导或平行的信号转导通路的激活突变.即使对关于癌症是怎样产生耐药性抗 体的了解很少,一些现象提示用抗 EGFR和抗HER抗体治疗的病人体内有耐药 机制的建立.在EGER的二次突变说明了免疫调节药物与 EGFR勺结合受到破坏 从而调节了反抗力.除此之外,最近的研究还证实了 EGFRE HER2勺信号转导通 路的激活可以分别绕过西妥昔单抗或曲妥单抗的抑制；这些包括 EGFRE体水平 增加,MET RTK勺扩增或过度表达,下游或平行激活信号转导途径.在癌症治疗中ME位体已经变成了最具关注的目标,由于很多研究说明, METS多种人类月中瘤中具有组成性

38、活性.它的失调可能是由于不同的机制包括过 度表达,基因扩增,激活突变和受体介导的刺激自分泌或旁分泌的增加.生殖细胞的激活突变的识别和遗传型肾乳头状癌直接证实了 METK人类月中瘤发生有关 的概念.MET勺酪氨酸激酶的结构域中激活突变位点已经在散发月中瘤中确定.然 而,在人类癌症中变化频繁的是转录表达的过程, 这个过程是由原癌基因激活诱 导抑癌基因失活和对特定的为 mRN破缺氧刺激的下调过程.在原发性月中瘤中由 基因扩增引起的METS度表达是少见的,但在肺癌和结肠癌中变得抗靶向其它 RTKs治疗的情况更频繁.临床证据说明癌细胞是沉溺在原癌基因中的细胞,在这种细胞中的METM有组织性活性并且它们的

39、抑制结果就是使其致瘤性被破坏. 然而,用小剂量的激酶抑制剂延长对嗜 MET1田胞的处理会导致二倍抗性的出现, 这种机制可以被维持比方 METH曾或突变,KRAS的扩增或EGFRC族成员的活化.在我们的研究中说明,在嗜MET?田胞中对MET#定抗体MV-DN30勺抗性获得 是由于MET®制数量的大量增加.这一现象白机理解释依赖于染色体外的MET复制的动态调节,造成了 一种癌症对治疗的适应性程序.MET±调的增加是由于MEM因扩增造成的这种现象并不明显当抗性细胞培养在有抗体这种抗体介导了 MET勺下调存在的条件下,但是在没有这种抗体存在的条件却是很明显清楚 的.我们观察到蛋白的增加平行下来是 METmRNA加的23倍.EBC1原代细胞 的ME