草菇厚垣孢子的分离纯化和保存

1、韶 关 学 院 毕 业 设 计题 目：草菇厚垣孢子的分离纯化和保存学生姓名：黄鸿佳学 号：09102042039系（院）：英东生命科学学院 专 业：生物技术班 级：09生物技术2班 指导教师姓名及职称：刘主 副教授起止时间： 2012 年 9 月 2013 年 5 月（教务处制表）草菇厚垣孢子的分离纯化和保存专业班级：09生物技术 黄鸿佳指导老师：刘主 副教授摘 要：本论文以草菇V23为材料，建立其厚垣孢子的磁力搅拌器搅拌、果汁机捣碎、手工石英砂研磨3种分离方法及蔗糖梯度离心纯化方法。结果显示：采用手工研磨方法分离，50%的蔗糖溶液梯度离心（6000 r/min，10 min）纯化，能分离到纯

2、净饱满的优质草菇厚垣孢子；且液体石蜡4 密封保存草菇厚垣孢子效果最好。此草菇厚垣孢子的分离纯化和保存方法的建立对草菇菌种的保藏和厚垣孢子育种具有重要意义。关键词：草菇；厚垣孢子；分离；纯化；萌发率 Isolation and preservation of Volvariella volvacea chlamydospore Abstract: Three isolation and purification methods of chlamydospore. including magnetic stirrer isolation method. fruit juice machine po

3、unded isolation method. manual quartz sand grinding isolation method and sucrose gradient centrifugation purification method. were builded on Volvariella volvacea V23 in this paper. The results showed that using manual quartz sand grinding isolation method,and 50 percent of sucrose gradient centrifu

4、gation. can help us get pure and superior chlamydospore. as well as it is the best preservation that putting chlamydospore at liquid paraffin and at 4 . It is of great significance that building the isolation and preservation of Volvariella volvacea chlamydospore.Key words: Volvariella volvacea; chl

5、amydospore；isolation；purification；germination rate目录1 引言(1)1.1草菇的简介(1)1.2草菇厚垣孢子及其厚垣孢子育种介绍(2)1.3实验的目的和意义(3)2 材料和方法(3)2.1实验材料(3)2.1.1供试材料(3)2.1.2实验试剂(3)2.1.3实验仪器(3)2.2 实验方法(3)2.2.1菌种培养(3)2.2.2厚垣孢子的分离.(4)2.2.2.1采用磁力搅拌器.(4)2.2.2.2采用果汁机捣碎.(4)2.2.2.3采用手工石英砂研磨.(4)2.2.3厚垣孢子的纯化.(4)2.2.3.1不同形状的厚垣孢子的萌发率.(5)2.2

6、.4不同组合的保存方.(5)2.2.4.1不同保存途径厚垣孢子的萌发率.(6)3 结果与分析(6)3.1最佳分离工艺的确定(6)3.2最佳纯化方法的确定(8)3.3厚垣孢子形状对萌发率的影响.(9)3.4最优保存方法的确定.(10)4 结论.(10)5 致谢(11)6 参考文献.(12)草菇厚垣孢子的无菌分离纯化和保存09生物技术：黄鸿佳指导老师：刘主 副教授1 引言1.1 草菇的简介草菇最早由广东韶关的南华寺中僧人发现并开始了人工的种植，在约在本世纪30年代由华侨传入世界各国，是一种重要的热带亚热带菇类，是世界上第三大栽培食用菌，我国是世界上草菇产量最多的国家，主要分布于华南地区。 草菇含有

7、丰富的营养价值，味道鲜美。其中100 g鲜菇就含有含207.7 mg维生素C，2.6 g糖分，2.68 g粗蛋白，2.24 g脂肪，0.91 g灰分。草菇蛋白质含含有丰富的氨基酸，约含18种氨基酸，其中必需氨基酸占40.4744.47%。此外，还含有磷、钾、钙等多种矿质元素。 草菇在植物分类学上属于真菌门，担子菌纲，伞菌目，鹅膏菌科，草菇属。学名为Volvariella Volvacea (Bull. exFr.) Sing 。 草菇是由菌丝体和子实体两部分组成。菌丝体是草菇的主体，在基质中不断生长，繁殖，起着吸收、运输和积累营养物质的作用。菌丝按其发育的顺序可分为第一次菌丝、第二次菌丝和第三

8、次菌丝。又分别称为单核菌丝、双核菌丝和结实性双核菌丝。菌丝白色至淡黄色，透明或半透明，大多数只有一个细胞核，也有两个细胞核或多个细胞核，无锁状联合，有少量或极大量的厚垣孢子，厚垣孢子淡黄色或紫红褐色，圆球形或椭圆状球形，直径3545 m。 子实体是草菇的繁殖器官，虽大形可见，但寿命极短，只有在出菇期大量集中地出现，形成周期性的菇峰和菇谷。它由菌盖、菌褶、菌柄和菌托等部分组成 。菌盖钟形，幼时黝黑，老时褪为灰褐色或灰白色，中央色深，外围色稍浅；菌肉白色，肥厚；菌盖完全展开后，中央稍突起，直径520 cm，边缘完整，表面光滑。菌褶离生，等型，约280380片，初期白色，后水红色，最终红褐色，稍密集

9、。曲柄圆柱形或顶端稍细，白色、肉质，没有菌环。菌托杯状。膜质白色，顶缘裂片状，灰黑色。孢子椭圆形或卵状椭圆形，8*5 m。草菇子实体初生时为白色小颗粒，形如鱼卵，以后逐渐长大如豆，如雀蛋，如鸭蛋。根据子实体发育的情况，大致可分为针头期、小钮期间（小菇蕾期）、钮期（菇蕾期）、卵形期（菌卵期）、伸长期和成熟期等六个阶段。 初生的菌蕾，大小如针头状，外菌幕没有斑点，白色。垂直切面，看不到菌盖和菌柄的区别，整个结构是一团菌丝细胞。以后，菌蕾球形，其顶端内侧中央，首先出现一条直的或弧形的裂缝，此缝随后形成一个拱形的腔。其外侧的假薄壁组织，分化为菌托，中央的突起物形成菌盖及菌柄原基。菌盖原基随菌蕾的发育逐

10、渐由四周扩展和下卷，发育成为小菌盖。由于菌盖原基向外周扩展的速度大于菌柄的加粗生长，以及由于菌柄原基的延长生长，因而菌盖和菌柄就同时形成。当菌蕾直径约0.51 cm时，已可看到菌盖内侧对称式的发生了不等型的菌褶。随着苗褶的发育，子实层的形成，内卷的菌盖也逐渐伸直。最后突破菌托的束缚，以极快的速度继续发育，菌柄伸长几乎达到全长程度。菌褶随孢子的成熟度自白色至水红色。随后担子相继发射出无数的孢子，并逐渐腐解。 草菇的生活史和其他菇菌类一样，是从担孢子萌发开始，经过菌丝体的生长发育，形成子实体，并产生新一代的担孢子而告终的。 草菇属初级同宗结合的菌类。担孢子萌发的菌丝或是自身发育，或与其他菌丝结合，

11、就可发生双核化，形成子 实体。当双核菌丝纽结形成子实体时，经历了针头期、小钮期等六个发育阶段。子实体成熟时弹射出无数担孢子，担孢子在适宜条件下萌发又开始新的一个生活周期。草菇完成一个生活周期所需的时间，大约46星期。除有性生活周期外，还有一个无性的小生活周期。即草菇的菌丝上经常产生大量的厚垣孢子，厚垣孢子在采件适宜时萌发成菌丝进入上述的有性生活周期。1.2草菇厚垣孢子及其厚垣孢子育种介绍 草菇，因其在食用菌中栽培方法最简单，出菇最快，原料也最丰富，极具开发利用价值，草菇是一种喜温性真菌，菌丝体在-24 低温存放12天就会失去生活力，长期来，草菇多采用室温保藏，但是室温保藏草菇，菌丝很容易衰老和

12、死亡，往往每隔12个月就要重新转管培养，随着转管次数增加，往往引起遗传形状的变化，从而影响菌种固有的特性的保持，为克服上述弊端，有必要研究草菇的保藏方法。鉴于草菇是担子菌中为数不多的菌丝能直接分化形成厚垣孢子的菌类之一，具有厚垣孢子是草菇的一个重要特征，厚垣孢子形状特点、数量等内容，往往是判别各级菌种质量好坏的重要指标之一。厚垣孢子是一种无形繁殖体，其培养物可以保持原菌株的遗传特性，且在营养和环境条件适合时12 d可以萌发形成菌丝体，长期以来都认为厚垣孢子因壁厚，对干旱，寒冷等不良环境有较强的抵抗力。查阅相关资料知道，在4 下，草菇厚垣孢子保藏14 d后，萌发率没有下降，有望成为低温保种的理想

13、材料，以解决常温下菌丝保藏易引起老化，退化等问题。且厚垣孢子容易获得，纯化简单，萌发率较高，是外援DNA导入，诱变育种的好材料，对草菇厚垣孢子的生长特性深入了解和研究，有利于指导相关生产育种。目前对草菇的研究工作主要集中在厚垣孢子的形态学，遗传学和细胞学等方面。1.3实验的目的和意义 本实验以草菇V23为材料，建立其厚垣孢子的磁力搅拌分离方法，果汁机捣碎分离方法、手工石英砂研磨分离方法及蔗糖梯度离心纯化工艺，研究草菇厚垣孢子的最优分离纯化工艺，为草菇厚垣孢子研究和草菇厚垣孢子育种奠定基础。2 材料和方法2.1 实验材料2.1.1 实验材料 草菇V23。2.1.2 实验试剂 蔗糖溶液、卡那霉素、

14、MgSO4、K2HPO4、75%乙醇。2.1.3 实验仪器 T6L-166离心机，上海安亭科学仪器厂；JA1003A电子天平，上海精天电子仪器有限公司；E220显微镜, 上海长方光学有限公司；01J2003-04型立式压力蒸汽灭菌筒, 上海东亚力容器制造有限公司；2.2 实验方法2.2.1 菌种培养菌种培养基：采用PDA培养基：去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g，琼脂20 ,水1000 ml，MgSO4,1.5 g；K2HPO4，3 g；步骤：马铃薯洗净去皮，再称取200 g马铃薯切成小块，加水煮沸（煮沸2030 min，能玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，加热，再加入琼脂，继续加热搅拌混匀

15、，待琼脂融完后，加入葡萄糖和MgSO4，K2HPO4，搅拌均匀，待冷却后补足水分至1000 ml，分装试管或者锥形瓶，加塞包扎，（121 ）灭菌30 min后取出，贮存备用。 保证试验培养接种块的菌龄等条件尽可能相同，用等厚度的培养基培养军中115d,再用接种环在菌落外缘一个同心圆挑取等量菌种块，接种于试验培养基中央，在超净工作台完成整个操作。2.2.2 厚垣孢子的分离 为了获得纯厚垣孢子，使其不受培养基质和菌丝体的干扰，建立三种分离工艺：磁力搅拌分离方法，果汁机捣碎分离方法、手工石英砂研磨分离方法。2.2.2.1 采用磁力搅拌器 在250 ml烧杯中加50 ml无菌水，用接种环刮下带菌丝厚垣

16、孢子导入杯中，磁力搅拌30 min后，静置10 min，弃去上清液，加60%的蔗糖溶液，6000 r/min,离心10 min。2.2.2.2 采用果汁机捣碎 用接种环刮下带菌丝厚垣孢子导入果汁机中，加入适量的无菌水，果汁机捣碎20到30 min，取其捣碎液静置10 min，弃去上清液，加60%的蔗糖溶液，6000 r/min,离心10 min。2.2.2.3 采用手工石英砂研磨 在研磨砵中加少量无菌水和少量石英砂，用接种环刮下厚垣孢子导入其中，手工研磨2030 min，后直接加无菌水，定容至10 ml，制成悬液，3000 r/min,离心5 min后弃去上清液，加60%的蔗糖溶液，6000

17、r/min,离心10 min。2.2.3 厚垣孢子的纯化 为了获得纯厚垣孢子，实验设置20% 、40%、60%、3个浓度的蔗糖溶液。实验步骤如下：在研磨砵中加少量无菌水和少量石英砂，用接种环刮下厚垣孢子导入其中，手工研磨2030 min，后直接加无菌水，定容至10 ml，制成悬液，3000 r/min,离心5 min后弃去上清液，加60%的蔗糖溶液，6000 r/min,离心10 min，吸取上层的孢子悬液置于离心管中，滴加20%、40%、60%的蔗糖溶液，6000 r/min,离心10 min。实验发现20%蔗糖浓度无明显纯化效果，40%、60%纯化效果相对明显，故设置45%和55%蔗糖浓度

18、，重复上述步骤，最终确定50%的蔗糖溶液孢子区带相对厚，纯化的效果最为明显。2.2.3.1 不同形状的厚垣孢子的萌发率 在研磨砵中加少量无菌水和少量石英砂，用接种环刮下厚垣孢子导入其中，手工研磨2030 min，后直接加无菌水，定容至10 ml，制成悬液，3000 r/min,离心5 min后弃去上清液，加50%的蔗糖溶液，6000 r/min,离心10 min。在蔗糖梯度液中出现的厚垣孢子区带，经镜检，区带中层多为饱满规则孢子，区带上层多为不规则孢子。取200 L区带中层的孢子悬液，用无菌水重复洗3次，再加无菌水3 ml，制成2管草菇孢子悬液，标记为A管，B管。分别取200 L不同的孢子悬液

19、，镜检后记录数据重复洗涤步骤，置于倒好的PDA培养基平板上，均匀涂板，保鲜膜密封封口，置于生化培养箱中培养35 d,观察记录孢子的萌发情况，计算萌发率。取200 L区带偏上层的的孢子悬液，用无菌水重复洗3次，再加无菌水3 ml，制成2管草菇孢子悬液，标记为C管，D管备用。镜检后记录数据重复洗涤步骤，置于倒好的PDA培养基平板上，均匀涂板，保鲜膜密封封口，置于生化培养箱中培养35 d,观察记录孢子的萌发情况，计算萌发率。2.2.4 不同组合的保存方法 用接种钩把厚垣孢子导入研磨砵，手工研磨2030min，后直接加无菌水，定容至10 ml，制成悬液，3000 r/min,离心5 min后弃去上清液

20、，加50%的蔗糖溶液，6000 r/min，离心10 min，再用移液枪吸出厚垣孢子层，在超净工作台内，用无菌水洗涤草菇厚垣孢子，然后晾干，再分别分装保存，分装方法以及保存途径见下表：表1 不同组合的保存方法保存途径温度常温保存4 -20 室内保存组1组4组7瓶装密封保存组2组5组8石蜡密封保存组3组6组92.2.4.1 不同保存途径厚垣孢子的萌发率67 d后，分别对9个组进行处理加无菌水3 ml制成草菇孢子悬液。分别取200 L不同的孢子悬液，镜检后重复洗涤步骤，置于倒好的PDA培养基平板上，均匀涂板，保鲜膜密封封口，置于生化培养箱中培养35 d,观察记录孢子的萌发情况，计算萌发率。3 结果

21、与分析3.1 最佳提取工艺的确定 在实验中建立的三种分离工艺，离心效果见下图1。 图1 三种分离工艺离心结果 A，磁力搅拌离心效果；B，果汁机捣碎离心效果；C，手工石英砂研磨离心效果 实验图表明：前两种分离工艺的离心液中均含有菌丝团和培养基质碎块，达不到提取要求；第三种分离工艺的离心液中厚垣孢子均匀分布，经镜检观察，见下图2，厚垣孢子均匀分布，且培养基和菌丝残末细碎贴壁，并与厚垣孢子完全分离。结果表明手工石英砂研磨是最优的分离工艺。图2 手工石英砂研磨工艺镜检图3.2 最佳纯化方法的确定 蔗糖梯度离心纯化效果见下图3。图3 各种浓度的纯化效果 A，20%, 40%, 60%离心效果图；B，45

22、%, 55%, 50%离心效果图 实验表明：20%蔗糖浓度无明显纯化效果，40%60%纯化效果相对明显。利用逼近原则，确定50%的蔗糖溶液孢子区带相对厚，经镜检观察，见下图4，结果表明区带中层多为饱满规则孢子，区带上层多为不规则孢子。纯化的效果最为明显。图4 纯化镜检图 A，区带中层镜检图；B，区带上层镜检图3.3 厚垣孢子形状对萌发率的影响不同形状的厚垣孢子的萌发率见下表2。表2 不同形状的厚垣孢子的萌发率组别ABCD镜检个数269279322298萌发个数8999231223萌发率（%）33.135.571.774.8 实验结果表明：规则饱满的厚垣孢子的萌发率分别71.7%和74.8%，高

23、于不规则的厚垣孢子的萌发率。3.4 最优保存方法的确定按表1 进行萌发率测定试验，实验测定结果见下表2.表3 不同保存途径厚垣孢子的萌发率实验组组1组2组3组4组5组6组7组8组9镜检个数289331360271294289323360365萌发个数64150280128230251162020萌发率（%）2245.377.747.278.286.955.55.4 实验结果表明在同一种保存途径下，当在室内保存，组1，组4，组7，的萌发率分别为：22%，47.2%，5%，研究证实草菇厚垣孢子在4 保存67 d的效果比较好，萌发率最高；在同一温度下，当在4 下保存，组4，组5，组6的萌发率分别为：47.2%，78.2%，86.9%，研究证实用石蜡密封保存草菇厚垣孢子67 d的效果比较好，萌发率最高。4 结论 采用手工研磨方法分离，50%的蔗糖溶液梯度离心（6000 r/min，10 min）纯化，能分离到纯净饱满的优质草菇厚垣孢子；液体石蜡4 密封保存草菇厚垣孢子效果最好。致谢 这次毕业论文设计我得到了很多老师和同学的帮助，其中我的论文指导老师刘主老师对我的关心和支持尤为重要。在学习中，老师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华