流式细胞术的临床应用ppt课件

1、流式细胞术在临床上的运用流式细胞术在临床上的运用深圳市人民医院临床医学研讨中心深圳市人民医院临床医学研讨中心 李富荣李富荣 第一部分 流式细胞仪FCM)任务原理FCMFCM系统构造系统构造流体系统：样本流、鞘液流体系统：样本流、鞘液光学系统：激光光源、分光镜、滤片、光学系统：激光光源、分光镜、滤片、 散射光和荧光探测器散射光和荧光探测器分选系统：压电晶体、液流成滴、加电分选系统：压电晶体、液流成滴、加电 系统、偏转系统系统、偏转系统数据处置系统：计算机任务站数据处置系统：计算机任务站FCMFCM任务原理流程：任务原理流程：样本血液实体组织单细胞悬液荧光染料特异染色的样本上机细胞单列经过丈量区1

2、.散射光信号2.荧光信号分别、搜集、分析、光信号细胞理化特性分析图参与荧光染料激光激发流式细胞仪的构造及原理流式细胞仪的构造及原理FCMFCM丈量光信号获取与分析丈量光信号获取与分析散射光信号前向散射光(FSC)-细胞大小侧向散射光SSC)-细胞粒度膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量FSC信号越大，阐明细胞体积越大；反之，那么越小。SSC信号越大，阐明细胞粒度越大；反之，那么越小。根据根据FSC-SSCFSC-SSC二维点图，可以容易区分二维点图，可以容易区分Lym(R3)Gran(R1)Lym(R3)Gran(R1)与与Mono(R2)Mono(R2)R1R2Incident Light So

3、urceRight Angle Light Dectector a Cell ComplexityForward Light Detector a Cell Surface AreaR3R2R1根据根据FSC-SSCFSC-SSC二维点图，可以容易的区分出二维点图，可以容易的区分出Lym(R3) .Gran(R1)Lym(R3) .Gran(R1)与与Mono(R2)Mono(R2)流式细胞术常用染料及检测波长流式细胞术常用染料及检测波长荧光染料的发射不同波长荧光染料的发射不同波长DNA DNA 和和RNARNA荧光探针的理化特性荧光探针的理化特性荧光探针荧光探针 分子量分子量 结合方式结合方

4、式 碱基特异性碱基特异性 激发锋激发锋nm) nm) 发射锋发射锋(nm)(nm)P1 668 P1 668 嵌入嵌入 无无 493 630493 630EB 394 EB 394 嵌入嵌入 无无 482 616482 616MI 1069 MI 1069 非嵌入非嵌入 G-C 320,445 575 G-C 320,445 575 CA3 1183 CA3 1183 非嵌入非嵌入 GC 320,445 575 GC 320,445 575 HO33258 624 HO33258 624 非嵌入非嵌入 AT 343 480 AT 343 480 HO33342 615 HO33342 615

5、非嵌入非嵌入 AT 343 455AT 343 455DAPI 350 DAPI 350 非嵌入非嵌入 AT 540 650AT 540 6507-AAD 1270 7-AAD 1270 嵌入嵌入 GC 540 655 GC 540 655 AO 370 AO 370 嵌入嵌入 ( (双链双链 无无 492 530492 530 静电单链静电单链 640640PY 303 PY 303 嵌入嵌入 ( (双链双链 GCAT 549-562 565-574GCAT 549-562 565-574 静电单链静电单链细胞周期分析细胞周期分析经过荧光探针对细胞周期进展相对经过荧光探针对细胞周期进展相对D

6、NADNA含量的测定，可分析细含量的测定，可分析细胞周期各时期的百分比，周期动力参数及胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNADNA异倍体异倍体G1SG2GoM分选系统分选系统Sorting)Sorting)根据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体：根据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体：电荷式分选电荷式分选稳定液流丈量区液滴构成液滴充电液滴偏转分选搜集逻辑电路电荷式分选电荷式分选通道式分选通道式分选稳定液流丈量区逻辑电路捕获管分选搜集 第二部分第二部分 流式细胞术在临床医学中的运用流式细胞术在临床医学中的运用流式临床运用流式临床运用淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析Th1/Th

7、2 肿瘤学肿瘤学HLA-B27PNH 四聚体四聚体血小板活化血小板活化 细胞凋亡细胞凋亡 移植免疫移植免疫常常用用淋淋巴巴细细胞胞亚亚群群报报告告方方式式R深圳深圳市人市人民医民医院流院流式细式细胞术胞术报告报告单方单方式式HLA-B27经过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞T淋巴细胞，检测其B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于规范微球荧光强度那么为阴性，反之为阳性。 Th1/Th2细胞 肿瘤学 细胞凋亡细胞凋亡 移植免疫移植免疫 四聚体四聚体Tetramer-原理原理内源性抗原内源性抗原外源性抗原外源性抗原Tetramer-原理原理MHC Class I-HLA-A2T

8、etramer-原理原理Tetramer-原理原理国外医学免疫学分册 2019；24(2):102-105HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽限定性肿瘤抗原肽抗原特异性抗原特异性CTL的分析方法的分析方法51Cr释放实验释放实验PCR法法酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT)扩增特异T淋巴细胞受体Tetramer法法间接法需大量的特异性CTLs作为效应细胞需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力难以广泛运用敏感性高但只能用于知TCR基因型的特异性CTLs检测直接法敏感性高不受TCR基因型的限制有限稀释法有限稀释法(LDA)用用Tetramer法研讨阐明，外周血中仅有法研讨阐明，外周

9、血中仅有0.2-2.5% 的的CD8+细胞对细胞对CMV和和EBV特异特异Tetramer法法Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cellsJ. Science,2019,280:227了解病毒特异性CTL和记忆性CTL方面的一项革命检测病毒特异性CD8细胞的金规范(Gold Standard)Tetramer-运用运用感染性疾病感染性疾病HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSVBreast, Prostate, Me

10、lanoma, Colon, Lung, Cervical, Ovarian and LeukemiaDiabetes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligoEBV and CMV 移植移植 本身免疫性疾病本身免疫性疾病肿瘤肿瘤感染性疾病感染性疾病Tetramer-运用运用-例证例证含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的去除率无关慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者用

11、黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞用Tetramer分别，富集GVHD(移植物抗宿主反响)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，呵斥骨髓移植失败-HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床治疗效果HLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应对才干 移植移植肿瘤肿瘤 第三部分第三部分 定量流式细胞术定量流式细胞术 定量流式细胞术的概述定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。对计量，而不是阳

12、性细胞的相对百分数。原理：经过检测规范微球的荧光强度获得规范曲线，原理：经过检测规范微球的荧光强度获得规范曲线，经过规范曲线或方程求得待测细胞的某种生物分经过规范曲线或方程求得待测细胞的某种生物分子的准确数值，从而反响在某种生理、病理条件下待子的准确数值，从而反响在某种生理、病理条件下待测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研讨、诊断及测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研讨、诊断及治疗等具有重要意义。治疗等具有重要意义。血小板外表抗原定量血小板外表抗原定量- PLATELET Calibrator Kit- PLATELET Calibrator Kit特点特点可定量与血小板相关的任何抗原(如CD

13、41, CD61, CD42a等)免洗间接法一抗亚型为IgG1, IgG2a或IgG2b定量范围宽(500-90,000 分子/血小板 )定量准确，CV值(变异系数)小血小板外表抗原定量血小板外表抗原定量- PLATELET Calibrator Kit- PLATELET Calibrator Kit规范曲线规范曲线血小板外表抗原定量血小板外表抗原定量- PLATELET Calibrator Kit- PLATELET Calibrator Kit结果结果血小板外表抗原定量血小板外表抗原定量- PLATELET Calibrator KitCD41/61复合物变形与复合物变形与Firbri

14、nogen结合，为初期血栓构成的关键步骤结合，为初期血栓构成的关键步骤PLATELET Fibrinogen Kit运用运用心血管疾病(不稳定心绞痛，心肌堵塞等)监测抗凝集治疗(如RepPro, Integrelin, Plavix, Ticlid等)检测GPIIb/IIIa(CD41/CD61)受体Fibrinogen结合才干血液体外(in vitro)活化(ADP等诱导)后，检测Fibrinogen结合才干血小板活化形状(ex vivo)标本处置标本处置PLATELET Fibrinogen Kit白细胞外表抗原定量白细胞外表抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit

15、特点特点可定量与白细胞相关的任何抗原(如CD3, CD4, CD55, CD59等)单个定量(用一个单抗，如CD28抗体定量白细胞外表CD28分子数)多参数定量(如用CD8设门来定量CD8+ T细胞上CD28分子数)全血和分别的细胞(如细胞株等)均可间接法一抗亚型为IgG1和IgG2a定量范围宽(1000-300,000 分子/白细胞 )定量准确，CV值(变异系数)小白细胞外表抗原定量白细胞外表抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit规范曲线规范曲线白细胞外表抗原定量白细胞外表抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit结果结果白细胞外表抗原定量白细

16、胞外表抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator KitBlood Dendritic Cell Enumeration KitDCDC作用：作用：1.1.树突状细胞树突状细胞dendritic cell,DCdendritic cell,DC为一为一群非均一性专职抗原递呈细胞，与群非均一性专职抗原递呈细胞，与MHCMHC二类二类分子结合向其它免疫活性细胞传送抗原信息。分子结合向其它免疫活性细胞传送抗原信息。 2.2.骨髓样骨髓样DCDCMDCMDC和淋巴样和淋巴样DC(PDC).DC(PDC).在诱在诱导和调控免疫应对方式上完全不同：首先它导和调控免疫应对方式上完全不同：首先它

17、们表达不同的抗原识别受体并对不同的抗原们表达不同的抗原识别受体并对不同的抗原起作用；表达不同的细胞因子受体并对不同起作用；表达不同的细胞因子受体并对不同的细胞因子起反响，即使遭到一样的抗原刺的细胞因子起反响，即使遭到一样的抗原刺激。骨髓样激。骨髓样DCDCMDCMDC与与Th1Th1效应相关效应相关, ,而淋而淋巴样巴样DCDCPDCPDC与与Th2Th2效应有联络；效应有联络； 曾经运用的领域包括：曾经运用的领域包括：1 1SLESLE病人病情和疗病人病情和疗效察看；效察看；2 2AIDSAIDS病人免疫机能分析；病人免疫机能分析；3 3病病毒性肝炎病人免疫情况研讨；毒性肝炎病人免疫情况研讨

18、；4 4疫苗研讨。疫苗研讨。特点特点简便、简便、快捷、快捷、绝对计数绝对计数DC亚群数亚群数/ml最新技术最新技术计数血液中循环内皮细胞的规范方法计数血液中循环内皮细胞的规范方法循环内皮细胞循环内皮细胞(CEC)添加于添加于CELLQUANT FF-CD146急性冠状动脉综合征血小板减少性紫癜镰刀细胞贫血败血症狼疮肾病综合征器官移植排斥手术创伤癌症传统方法传统方法显微镜检，手工计数。费时，费力，无法规范化新技术新技术新规范新规范CELLQUANT FF-CD146免疫磁珠富集与3色流式细胞术结合仅需1 mL血整个过程不到1个小时灵敏度高：1mL血中可检测出10个循环内皮细胞反复性好，室间差(Interlaboratory CV)小方法方法CELLQUANT FF-CD146将包被CD146单抗的铁磁性纳米颗粒(CD146FF)与1mL 血孵育富集的CD146+细胞用以下试剂染色 PI(碘化丙啶) (确定有核细胞) CD45-FITC(排除WBC(白细胞)干扰) CD146-PE单抗(识别CD146抗原的另一位点) 规范