第9章酶促反应动力学

1、l浓度对酶反应速率的影响l抑制剂对酶反应速率的影响l温度对酶反应速率的影响lpH对酶反应速率的影响l激活剂对酶反应速率的影响酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。化学动力学化学动力学的研究内容具体为确定反应速率，了解浓度、温度、pH值、催化剂等因素对反应速率的影响，揭示化学反应机制。反应速率：单位时间内反应物或者生成物浓度的改变。v=()dc/dt一、化学动力学基础一、化学动力学基础化学反应化学反应的方向、可能性和限度化学反应的速率和机制化学热力学(结果)化学动力学（过程）反应速率：单位时间内反应物或者生成物浓度的改变。1. 反应速率及测定v=(c2-c1)/(t2

2、-t1)= -dc/dt监测反应物的浓度变化：监测生成物的浓度变化：v=(c2-c1)/(t2-t1)= dc/dt反应分子数反应级数整个化学反应的速率服从哪种分子反应速率单分子反应 A P例如：放射性元素的蜕变、分子重排、同分异构体互变等。v=-dc/dt=kc双分子反应 A+B P+Q例如：2H2+O2 2H2O; v=-dc/dt=kc1c2一级反应 v=-dc/dt=kc二级反应 v=-dc/dt=kc1c2零级反应 v=-dc/dt=k例如酶促反应的最大速度2. 反应分子数及反应级数反应中真正相互作用的分子数目总反应速率与浓度的关系能以单分子反应的速率方程式表示。注意：水解反应（双分

3、子、一级反应）以双分子反应的速率方程式表示；反应速率与反应物质浓度二次方成正比反应速率与反应物浓度的关系分类3. 各级反应的特征：1. 一级反应：t1/2 0.693/k不论反应物初浓度的多少，其半衰期是一样的2. 二级反应t1/2=1/ka初浓度越大，反应物减少一半所需时间越短3. 零级反应t1/2=a/2k初浓度越大，半衰期越长v=-dc/dt=kcv=-dc/dt=kc1c2v=-dc/dt=k概念 酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学，是酶工程研究中的一个重要内容。影响因素包括有 酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。 研究一种因素的影响时，其余各

4、因素均认为恒定。二、酶促反应动力学二、酶促反应动力学02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrate(um ol/L)Rate of Reaction(v)SvHenri的蔗糖水解实验保持酶浓度不变1903 年Henri用蔗糖酶水解蔗糖研究底物浓度与反应速率的关系，当保持酶浓度不变时，得到双曲线图，并提出酶底物中间络合学说。2.1 底物浓度对酶反应速度的影响2.1.1 中间络合物学说l酶与底物先络合成一个过渡态络合物，然后络合物进一步分解为产物和游离态酶。这个学说的前提是酶与底物反应的“快速平衡”，即在反应的开始阶段，两者反应速

5、度很快，迅速建立平衡关系。 l 第一步：酶（E）与底物（S）作用，形成酶-底物中间产物 （ES）：E+SES (k1和k2是正、逆反应的速度常数) 第二步：中间产物分解，形成产物（P），释放出游离酶(E)： ESP+El 许多实验事实证明了ES复合物的存在，ES复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。E+SESE+PK1K2K3酶和底物中间复合体的证据：ES复合物已经被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到；酶和底物形成ES复合物后光谱特性发生改变；形成ES复合物后，酶的物理性质，例如溶解度或热稳定性发生改变；某些酶和底物相互作用的ES复合物已经得到分离；酶和底物可形成共沉淀。在底物浓度低时,

6、 酶未被饱和，反应速度V 取决于底物浓度，与底物浓度S成正比，表现为一级反应特征。02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrate(um ol/L)Rate of Reaction(v)2.1.2 酶被底物饱和现象和“中间络合物”假说 E + S ES E + P一级反应SvEHenri的蔗糖水解实验保持酶浓度不变随着底物浓度的增高, ES生成量多，反应速率取决于ES浓度，而反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrat

7、e(um ol/L)Rate of Reaction(v)v混合级ES E + S ES E + P02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrate(um ol/L)Rate of Reaction(v)Vmaxv零级反应E当底物浓度达到相当高时，底物浓度对反应速率影响变小，最后反应速率与底物浓度无关，反应达到最大速率 Vmax。只有酶的催化反应具有这样的饱和现象。 E + S ES E + P2.2 2.2 酶促反应动力学酶促反应动力学 （1 1）米氏方程）米氏方程 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中

8、间络合物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。V=Vmax SKm + SKm 米氏常数Vmax 最大反应速度米氏方程米氏方程Michaelis和Menten根据中间复合物学说提出：E+SESE+Pl Briggs 和 Haldance对其进行修正，提出了稳态理论：E+SESE+P所谓稳态是指反应进行一段时间以后，系统复合物ES的浓度由零增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度和产物浓度在不断变化，ES也在不断生成和分解，但是当反应系统中ES的生成速度和分解速度相等时候，ES浓度保持不变的反应状态成为稳态，即 dES/dt=0简

9、单起见，只考虑单底物和单产物的催化反应。简单起见，只考虑单底物和单产物的催化反应。在反应初期，在反应初期，PP的浓度非常低，因此整个反应可简化为的浓度非常低，因此整个反应可简化为（2）米氏方程的推导(Michaelis-Menten) 根据中间络合物学说，酶促反应分两步进行:E+ SESE + PK1k2k3k4E+ SESK1k2ESE + Pk3k4E+ SESE + PK1k2k3l在整个酶促反应中，反应的限速步骤为在整个酶促反应中，反应的限速步骤为ESES分解生成分解生成EE和和PP的过程，因此反应的初速度可以表示为的过程，因此反应的初速度可以表示为l在反应过程中，游离的酶浓度可以表示

10、为在反应过程中，游离的酶浓度可以表示为l在反应过程中，底物浓度在反应过程中，底物浓度SS是远远高于酶浓度的是远远高于酶浓度的Et Et ，即，即SEt, SEt, 所以游离的底物浓度可以用所以游离的底物浓度可以用SS计算。计算。V = k3ES(EtES) Sk2+k3ES k1V=Vmax SKm + S当反应速度等于最大速度一半时当反应速度等于最大速度一半时, ,即即V = 1/2 Vmax, Km = S V = 1/2 Vmax, Km = S 上式表示上式表示, ,米氏常数是反应速度为米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。最大值的一半时的底物浓度。因此因此, ,米氏常数的单位

11、为米氏常数的单位为mol/Lmol/L。米氏方程曲线米氏常数（米氏常数（Km）的意义）的意义米氏常数（米氏常数（Km）的意义）的意义1、Km值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的浓度无值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的浓度无关关; Km值作为常数只是对一定的底物、一定的值作为常数只是对一定的底物、一定的pH、一定的温度条件而、一定的温度条件而言，言，测定酶的测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段值可以作为鉴别酶的一种手段。多数酶的。多数酶的Km介于介于10-610-1 mol/L 之间。之间。2、 Km可以判断酶的专一性和天然底物可以判断酶的专一性和天然底物几个底物就有

12、几个几个底物就有几个Km值；值；Km最小的底物为最小的底物为最适底物最适底物。因此。因此1/Km可近似表示酶对底物的亲和性可近似表示酶对底物的亲和性V=Vmax SKm + S若已知某个酶的若已知某个酶的Km，就可以计算在某一底物浓度时，反应，就可以计算在某一底物浓度时，反应速率相当于速率相当于Vmax的百分比：的百分比：V=Vmax SKm + S例如，当S=3Km时， V=0.75Vmax若若Km已知，任何底物浓度下被底物饱和的酶百分数：已知，任何底物浓度下被底物饱和的酶百分数：f =v/Vmax例如：过氧化氢酶Km值为0.025mol/L, 当底物过氧化氢浓度为0.1mol/L 时，过氧

13、化氢酶被底物饱和的百分数为80%Vmax和和k3（kcat）的意义）的意义当S很大时,v=vmax=k3EtK3 表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，这个常数又叫转换数，称为催化常数（kcat）， kcat越高，表示酶的催化活力越高，所以，Vmax=kcatEES E+Pk3kcat/Km 的意义的意义生理条件下，大多数酶并不被底物所饱和，体内 S/Km 介于0.011 之间。v=Vmax SKm+SVmax=kcatEtv=kcatEt SKm+S当SKm时，自由酶浓度=Etv=kcatKmES比较不同酶或者同一种酶催化不同底物的催化效率2.3 作图法测定作图法测定Km和和

14、Vmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v斜率斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmax作图法测定作图法测定Km和和Vmax双倒数作图法双倒数作图法将米氏方程取双倒数：=v=Vmax SKm+S2.4 多底物酶促反应动力学 大多数酶反应包含一种以上的底物： A+BP+Q1) 序列反应-有序反应机理-需要NAD+或NADH+的脱氢酶的反应属于这种 B P E+A EA EAB EPQ EQ E+Q 2) 序列反应-随机机理： E+AEA B Q EPE+P EABEPQ E+BEB A P EQE+Q3) 乒乓反应机理（转氨酶的反应属于

15、这类型） ： A P B Q E E顺次式(sequential)乒乓式(ping-pong)当P1, P2 = 0 时三、酶的抑制作用没有引起酶的失活，但使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用；能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂；抑制剂对酶的抑制作用具有选择性；酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：l在化学结构上与底物分子状态相似l能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。l根据酶活性变化可分为可逆与不可逆二类 不可逆抑制作用：抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶活的永久性失活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。（详见p373代表性抑制剂） 可逆抑

16、制作用：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。l根椐可逆抑制剂与酶结合情况可分为竞争性抑制、非竞争性抑制与反竞争性抑制三类。三、酶的抑制作用3.1 竞争性抑制l抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。l竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，提高底物浓度可以降低抑制作用。Vmax不变，不变，Km变大，双倒数作图与正常直线相交于纵轴变大，双倒数作图与正常直线相交于纵轴=竞争性米氏方程米氏方程=1+I/Ki3.2 非竞争性抑制

17、底物和抑制剂结构上没有共同之处，但酶可同时与底物及抑制剂结合形成三元复合物，但复合物不能进一步分解为产物。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。加入非竞争性抑制剂后，加入非竞争性抑制剂后，Km 虽然不变，虽然不变，Vmax减小减小=非竞争性米氏方程米氏方程3.3 反竞争性抑制l酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。l反竞争性抑制可用下式表示：=加入反竞争性抑制剂后，Km 、Vmax均减小，双倒数作图为一组平

18、行线。反竞争性米氏方程米氏方程I竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制竞争性抑制不改变Vmax，非竞争性抑制不改变Km，反竞争性抑制两者均变小；竞争性抑制改变横截距(Km 变大)、非竞争性抑制改变纵截距（Vmax 变小）总结四、温度对酶反应的影响 1、酶的最适温度：酶达到最大反应速度时的温度 最适温度是酶的特征之一，但不是一个特征常数，它与反应时间、溶液的离子强度、缓冲溶液种类有关102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity (%)最适温度2、温度对酶促反应的影响 温度升高,酶促反应速度加快；另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此酶的最适合温度是二者平衡的结果.3、大部分酶在60C以上失活变性。一般动物酶的最适温度在35-40C，植物酶的最适温度在40-50C。少数酶能耐受高温，如细菌耐高温淀粉酶在93C时活力最大，牛胰核糖核酸酶在100C时仍不失活。4、酶在干燥情况下比在潮湿情况下耐受的温度高，这一点可用于酶的保存。五、pH对酶反应的影响1、最适pH：酶具有最大的催