从患者开始谈基因检测的整个流程

1、从患者开始谈基因检测的整个流程题记：几颗玉米放进爆米花机器，出来便是爆米花；一个智力 一般的高中生放到人大附中，三年后出来就是国际一流大学新生； 二两五花肉和几个青椒交给一名厨师，出来的便是香喷喷的回锅 肉。可是这中间都发生了啥是什么重要步骤将初始原料打磨成了成 品10ml的血液或者一块肿瘤组织，最终变成了一份20页的检测报告这是怎么实现的中间都发 生了什么本文旨在回答这个问题。基因检测的整个流程可分为哪几个大的步骤概况性地了解一个事务 的框架是很有必要的，因为这样我们心里会有“底”。不管别人怎么分，我简单粗暴地把它分为四个程序:1，检测前咨询部分；2,实验室部分；3,信息分析部分；4，临床解

2、读部分。五脏俱 全的基因检测公司应该包含以上所有的四个程序，除非存在部分业 务外包的情况，例如有的公司只做临床解读部分。1 ）检测前咨询 部分：不是所有的癌症患者都应该检测，都值得检测，检测目的是 为了明确是否可 以使用靶向药物，还是仅仅为了玩，选择哪种产 品更加适合，这些都是需要在这部分搞清楚。2）实验部分：应该 取多少组织样本，测序过程中有哪些细节步骤，这可是个核心环 节。3）信息分析：实验部分做完以后所得到的是一大堆序列，不 分析就是一堆垃圾，信息部要做的就是从这些垃圾中挑选黄金。4）临床解读：黄金挑选出来不拿去换成大米然后进肚，那也没什 么用，基因检测的结果有什么意义，对临床实践又何指

3、导，全在这 里了。四个程序，每个程序又包含哪些 小工序呢通过上面的介绍， 我们可以大体了解基因检测分为四个程序，也明白四个程序主要做 什么。可是，每一个程序 又具体涉及哪些小程序呢剖析程序的过 程，就是知识差异化的过程。1，检测前咨询：患者预期、产品选 择；2，实验部分：样本获取与运输、DNA制备与文库构建、 质控与上机测序；3，信息分析部分：数据分析、报告初稿；4， 临床解读部分：检测报告、临床实践、报告解读/人文关怀。总而言之，简单来说，从明确患者的检测目的开始（用药指导，耐 药后寻找新的方案，仅检测一个基因或多个基因突变状态等）， 到选择合适的产品，然后获取规范的样本（血液，组织，唾液等

4、），然后合适的运输方式到达实验室，然后一些列的规范实验室 操作及数据分析，最后到科学的检测报告与咨询服务。这就是四个 程序所包含的内容。每一个程序分为许多小工序，每一个小工序又 有许多学问与讲究。下面将会详细介绍每一个小工序。程序一：检 测前咨询部分：患者预期。销售经理、产品经理、主治医生与患者 需要充分沟通，明确该基因检测的目的，知道检测技术的局限性， 做好患者的预期控制。：产品选择。对于基因检测产品来说，产品 选择几乎等同于检测基因的选择。哪些基因需要强行检测、哪些基 因推荐检测、哪些基因有一定的检测价值，这些需要阐述清楚。 最后，根据患者的经济情况与病情，综合选择（这是理想状况）。 实际

5、操作过程中，销售经理往往会以经济利益为导向。：临床信 息。患者的临床信息对于基因检测报告者有重要意义，信息掌握越 全面报告越个性化，咨询解读也更有针对性。因此，完整详实的 临床申请单需要提供。程序二：实验部分：样本类型。需要明确 一点，能够运用无创的尽量用无创（唾 液与血液），因为没有一 个患者希望无缘无故的在自己身上 打洞。固体：手术样本，穿刺样 本，石蜡包埋组织，石蜡切片组织；液体：全血，血清血细胞， 胸水，腹水，唾液。1）手术样本：（肿瘤组织50mg,癌旁正常 组织25mg,收到 组织后立即用至少5倍体积的10%中性福尔马 林固定液固定），切片25张以上，厚度5 : m，肿瘤细胞占比 5

6、0%,坏死组织区域2）穿刺样本：穿刺一针以上，肿瘤细胞占 比50%，坏死组织区域3 ）石蜡包埋组织：常温保存运输即 可，最好是1年以内。4）石蜡切片组织：常温保存运输即可， 最好是6周以内。5）全血：6ml-10ml for NGS （Streck管，含 有保存液，负压真空抽满），轻轻垂直平面90 °旋转10次，6- 25 C （常温）运输，3 （ 7）日内送达，可用干冰/制热剂制造维 持环境温度。6）血浆 血细胞（普通试管）：抽血后2h内将全 血4c 1600g离心10min，分别收集上清和沉淀至离心管中；上清 再4°C 16000g离心10min，收集上清血浆转 移至1

7、5mL离心管 中。血浆血细胞样品，均封口膜封口，干冰运输。7）胸水： 8）腹水：这两个情况比较少，至少我们公司很少遇到这样的样 本。：质控。血液样本是否合格，是否可以进行测序上机，样本 质量怎么样安捷伦2100生物分 析仪或者4200 TapeStation核酸 分析仪，通过DNA完整值（DIN ）来数字化基因组DNA的完整2） 3）的步骤可以用WGSFomentation Mix搞定。4）两端加接头：首先明确接头3 '端 有一个突出的碱基插入片段3,端有一个突出的碱基A ；其次， 这个工序是在插入片段两端加入东西；这个东西包括以下几个部分：测序接头（P5, P7;测序时用于与种植在F

8、low Cell 上的序列碱基互补配对用），Barcode （用于标识该条DNA片 段属于哪个样本，4个碱基），单分子编码序列（Index，用于 识别是哪条DNA片段，12个随机碱基）；其中丫型的序列是已 经商业化的试剂盒。5） PCR富集：如果样本不够，那么我们就 需要扩增它才能上机测序，这就是该环节存在的必要。由于每个经 4）处理的片段两端都有P5与P7,因此PCR引物只需设计与它们 配对的就行了。如果样本足够，这一步就省了呗。6）文库定量： 这里才应该是质控，也就是的步骤。7）基因捕获：我们只将需要 的DNA片段去测序，不需要的去测不是浪费钱吗于是在测序之前，我们就用这个工序将 目的DN

9、A挑选出来（为什么要捕获）；目前目标序列捕获方法有 3 矛中， NimbleGesn Sequence Capture array， AgilentSureSelect DNA Capture Array，Agilent SureSelect Target Enrichment System，值得注意的是不同捕获方法可能测序仪器有 不同的要求（捕获的方法有哪些；罗氏和安捷伦）；我们捕获的 探针设计可以自己设计，初步设计，需要检测的位点提交到商业公 司，真正的设计还是需要专业的商业公司来干（捕获探针的由 来）；例如目标区域为100Kb，好的探针 是100%覆盖这 100Kb，而有的商业公司达不到

10、，只能覆盖到97% ，那么意味着 有3%的区域捕获不到，更谈不上对这些区域测序了，所以覆盖率 很重要；对于这100Kb的目标片段，前10Kb探针捕获了 100个 片段，第10Kb-20Kb的探针捕获了 10个片段，那么这样的话就 是均一性不好，最终可能会得出结论10Kb-20Kb这一段突变频率 过高/过低，因此均一性很重要；如果一个探针设计出来想捕获目 标片段，却捕获到了别的垃圾片段，我们还对它测序，这不是浪费 钱吗所以，探针特异性很重要。(好的捕获是怎么样的)。8) PCR扩增：PCR再次扩增捕获的DNA片段，上机前再一次加足 样本量。9)文库再次定量：相当于上机前的再一次质量检测。： 上机

11、测序。通过前面的步骤，我们从患者身上的一块肿瘤组织或者 一管血开始，然后分离提纯我们需要的基因组DNA，再把这些 DNA打成小片段，然后再在这些DNA小片段两头接上识别标记 和测序接头，最后再通过基因捕获技术筛选出目的DNA，根据需 求PCR扩增。通过这么多步骤，就是为上机测序做准备。一句话，上机测序的过程就是读取这些DNA小片段的序列，如ATCTGGCTT.(-160bp)，这样万级、亿级的DNA片段个数。至于这些DNA片段是怎么样在机器上被 测出来的，这又是个大问题，我在液体活检有哪些这篇文章有 简要说明，这里不管它，毕竟世界上那么多事情，哪有想管就管得 了的呢至此，实验部分结束。程序三：

12、信息分析部分：下机数据 识别。数以亿计的DNA小片段，一大饼，杂乱无章，很多情况是 几十个患者的样本都一起的，更乱。一句话，这个步骤将属于不同 患者的DNA小片段放进不同的盒子里，分类。这是怎么实现的呢我们在构建文库的加接头步骤时，同时加上了 Barcode序列，同一个患者使用同一个Barcode，不同的患者使用不同的Barcode，那么计算机通过这个Barcode轻松识别然后放进不同的盒子里。值得注意的是，DNA是两条链，有的公司会两条链同时测序以增加准确 性,因此一个A患者会有两个盒子属于他(A1 ：正义链的DNA小片段集合； A2 :反义链的DNA小片段集合)。还值得注意的是，如果样本是

13、 血液，有的公司会同时检测cfDNA和gDNA，那么一个B患者就 会有四个盒子属于他(B1, B2, B3 , B4 ) °图像转换。下机的时 候那些DNA片段最初其实是图像格式的，例如红色表示碱基A，绿色表示碱基T，需要用专业工具将图像格式转换成序列。川umina公司提供专业软 件，只需对其调用就可以完成这一步骤。一句话：图像转换成序 列。：比对到基因图上。将这些上以亿级的DNA小片段归位， 如果你是1号染色体的第500位到第650位之间的片段，就把你 归到这个位置下面。当然，1号染色体上的这个位置下面一般不止 一条DNA片段，毕竟有一个概念叫做测序深度，如果测序深度为 10000

14、，那么理论上该位置下面就应该有10000条DNA片段。怎 么控制是10000条呢这在上机之前构建文库时，通过调节PCR 扩增来实现。一句话：将散乱的DNA小片段比对到参考基因组 上，从而实现它们的定位。这个参考基因组是国际权威数据库给出 的，供给全世界所有人使用。基因组：；比对软件BWA ：；： 计算突变频率。假如1号染色体的500位到第650位有10000 个DNA片段，那么测序深度就真的是10000吗在这里需要做一个 辨别，如果这10000条DNA片段有 9000条是- 一模一样的，那 么我们认为这是一条DNA片段PCR扩增出来的，这900。条只能 算作1条，这时候有效测序深度为1001

15、°在某个特定的位点，如 果这1001条DNA片段有100条发生同样的与参 考基因组不一样 的变化，我们就认为该点的突变频率为10%。这10%的突变频率（血液肿瘤驱动基因突变为例）意 味着：血液中的cfDNA有10% 是ctDNA，从而反应患者的肿瘤病灶有一部分癌细胞发生了该突 变，若有针对该位点的靶向药，那么可根据情况推荐使用。值得注 意的是，如果有效测序深度只有100，那么就有可能漏掉一些典型的突变，所以有 效测序深度足够是非常重要的。这里有一个问题：某个特定位点的 变化，怎么样才算真正的突变呢冷泉港实验室的VarScan软件来 判定SNV和INDEL，顺便说一句要判定真正的突变很难，国际 上有不同的看法。VarScan :;: 1）原始数据过滤；2）数据比对B