八血糖的测定葡萄糖氧化酶法

1、实验十 血糖的测定血液中的葡萄糖称血糖。正常人血糖浓度较恒定，维持在 3. 9mmol/L6. 1mmol/L 之间。血糖浓度的相对恒定是机体进行正常生理活动的前提条件之一，有着双重实际意义：其一，维持稳定的能源供给，满足机体在各种生理状态下对能量的需求。其二，保证机体 不因进食致血糖浓度过高，导致糖的丢失。因此，血糖的测定是临床生化检验实验室的常规检测项目。血糖测定按其发展过程及 反应原理的不同，大致分三类：氧化还原法，缩合法（主要有邻甲苯胺法），酶法（主要有己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法）。下边介绍两种方法供选择。一、葡萄糖氧化酶法【目的】1 . 了解葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理，能进行血糖测

2、定的操作。2 .掌握血糖测定的临床意义。 【原理】葡萄糖氧化酶（glucose oxidase , GOD）能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。后 者在过氧化物酶（peroxidase , POD）乍用下，分解为水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醍类化合物，即 Trinder 反应。其颜色的深浅在一定范围内 与葡萄糖浓度成正比，在505nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血糖的浓度。反应式如下：GOD 葡萄糖 + O2 + 2H2O a 匍匐糖酸+ 2H2O22H2O2 + 4-氨基安替比林+酚-POD红色酶类化合物【器材】试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度

3、计【试剂】1.0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.0）称取无水磷酸氢二钠 8.67g及无水磷酸二氢钾 5.3g溶于800ml蒸储水中，用1mol/L 氢氧化钠（或1mol/L盐酸）调节pH至7.0 ,然后用蒸储水稀释至 1L。2 .酶试剂称取过氧化物酶1200U,葡萄糖氧化酶1200U, 4-氨基安替比林10mg叠氮钠100mg 溶于上述磷酸盐缓冲液 80ml中，用1mol/L NaOH调pH至7.0,加磷酸缓冲液至 100ml。置冰箱彳存，4 C可稳定3个月。3 .酚溶液称取重蒸储酚100mg溶于100ml蒸储水中（酚在空气中易氧化成红色，可先配成500g/L的溶液，贮存于棕色瓶中，用时

4、稀释），用棕色瓶贮存。4 .酶酚混合试剂取上述酶试剂与酚溶液等量混合，4C可以存放一个月。5 . 12mmol/L 苯甲酸溶液溶解苯甲酸1.4g于蒸储水约800ml中，加温助溶，冷却后加蒸储水至 1L。6 .葡萄糖标准贮存液（100mmol/L）称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g ,溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，并移入100ml容量瓶内，再以 12mmol/L苯甲酸溶液加至 100ml。7 .葡萄糖标准应用液（5mmol/L）吸取葡萄糖标准贮存液 5.0ml于100ml容量瓶中，加12mmol/L苯甲酸溶液至刻度。【操作】取3支试管，编号，按下表操作。表3-12血糖测定操作步

5、骤(ml)血清一一0.02葡萄糖标准液一0.02一蒸储水0.02一一酶酚混合液3.03.03.0混匀，置37 C水浴中保温15分钟，在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标 准管及测定管吸光度。【计算】测定管吸光度血糖（mmol/L） =X 5标准管吸光度血清葡萄糖（mmol/L）=标准管吸光度测定管吸光度【注意事项】1 测定结果如超过20mmol L， 应将标本用生理盐水稀释后再测定，结果乘以稀释倍O2若酶酚混合试剂呈红色，应弃之重配。因标本和标准用量少，其加量是否准确对 测定结果影响较大，故其加量必须准确。3 .GOD-PO法的第一步反应特异性高，而由POD崔化的第二步指示反应是非特异

6、性的，易受标本中尿酸、维生素C谷胱甘肽、胆红素等还原物的干扰，这些物质与色素原竞争H202,使测定结果偏低。4 Trinder 反应由 Trinder 于 1969 年提出。后经许多学者改进，采用2， 4-二氯酚、2- 羟 -3 ， 5-二氯苯磺酸等代替苯酚，由于这些化合物氧化生成的色素的摩尔吸光系数均高 于苯酚，使反应灵敏度得以提高。【正常参考范围】 3.9 6.1mmol/L【临床意义】1. 生理性高血糖可见于摄入高糖饮食或注射葡萄糖后，或精神紧张、交感神经兴奋，肾上腺分泌增加时。2. 病理性高血糖糖尿病：病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。对抗胰岛素的激素分泌过多：如甲状

7、腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进、腺垂体功能亢进、胰岛 a -细胞瘤等。颅内压增高：颅内压增高（如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等）刺激血糖中枢，出现 高血糖。脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。3. 生理性低血糖饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。4. 病理性低血糖胰岛素分泌过多：由胰岛 3细胞增生或胰岛 3细胞瘤等引起。对抗胰岛素的激素分泌不足：如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功 能减退等。严重肝病患者：肝贮存糖原及糖异生功能低下，不能有效调节血糖。【结果及分析】【思考题】1 .血糖有哪些来源和去路，机体是如何调节血糖浓度恒定的？2 .酶试剂为

8、什么要用磷酸缓冲液配制，用蒸储水是否可以，为什么?二、邻甲苯胺法【目的】了解测定血糖的原理和方法，要求在实验中培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力。【原理】葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺，后者脱水生成雪夫 （Schiff ）碱，再经结构重排，生成有色化合物。颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。其反 应式如下：葡萄糖+ 邻甲苯胺 葡萄糖邻甲苯胺葡萄糖邻甲苯胺 -H2O雪夫碱【器材】试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计【试剂】1 .邻甲苯胺试剂于940ml冰醋酸中加入硫月尿1.5g,邻甲苯胺60ml,混合，直至硫月尿完全溶解,置棕色试 剂瓶中，室温保存。新配试剂应放

9、置24小时后（待老化）使用。此试剂腐蚀性强，避免接触皮肤，应用自动吸管加液。2 . 12mmol/L苯甲酸溶液于900ml蒸储水中加入苯甲酸 1.4g,加热助溶，冷却后置于1L容量并S中，加蒸储水至 刻度。3 .葡萄糖标准储存液（100mmol/L）称取无水葡萄糖（预先置 80c烤箱干燥至恒重，移置干燥器内保存）1.802g,溶解于80ml苯甲酸溶液中，移置100ml容量并S中，再加苯甲酸溶液至刻度。4 .葡萄糖标准应用液（5mmol/L）取葡萄糖标准储备液 5ml,置于100ml容量瓶中，加苯甲酸溶液至刻度。【操作】1 .取16 x 150mm式管3支按下表进行操作：表3-13 血糖测定操作步骤ml测定管标准管血清或血浆0.1一一葡萄糖标准应用液一0.1一蒸储水一一0.1邻甲聚胺试剂3.03.03.02 .将上述各管混匀放入沸水浴中加热12分钟，取出用自来水冷却 5分钟。注意在煮沸时水浴中的水面必须高于试管内的液面。否则则温度不均而影响比色。3 .用波长630nm分光光度